Microbial Hair: It's Electric

ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 

 ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 

Μελέτη ανάπτυξης και διαφοροποίησης κυτταρικών πληθυσμών μετά από επίδραση μικρορευμάτων και ηλεκτρομαγνητικών πεδίων 

ΑΔΑΜΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΙΑ 

Επιβλέπων: Αν. Καθ. Πουλάς Κωνσταντίνος 

ΠΑΤΡΑ, 2016 

 GRADUATE PROGRAM 

DEPARTMENTS OF CHEMISTRY – PHARMACY – MEDICINE 

MEDICINAL CHEMISTRY – DRUG DISCOVERY AND DESIGN

                                      MASTER THESIS

 Study for the development and differentiation of cell populations after treatment with microcurrent and electromagnetic fields

 ADAMOPOULOU MARIA (Α.Μ.: 132) 

Supervisor: Assoc. Prof. Poulas Konstantinos PATRAS, 2016 

Η παρούσα ΜΔΕ αφιερώνεται   Στα παιδιά μου

ΠΡΟΛΟΓΟΣ 

Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει τίτλο “Μελέτη ανάπτυξης και διαφοροποίησης κυτταρικών πληθυσμών μετά από επίδραση μικρορευμάτων και ηλεκτρομαγνητικών πεδίων” και πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών “Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων” υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κ. Πουλά και σε συνεργασία με το εργαστήριο του Καθηγητή Φυσιολογίας του Τμήματος Ιατρικής κ. Γ. Σταθόπουλου.

 Ένα μεγάλο ευχαριστώ: 

Στην Οικογένειά μου για την στήριξη που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια και ιδιαίτερα στα παιδιά μου.

 Στον Επιβλέποντα Καθηγητή κ. Πουλά Κωνσταντίνο για την ευκαιρία που μου παρείχε να ασχοληθώ με ένα πρωτοπόρο ερευνητικό αντικείμενο και την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου.

 Στον κ. Γεώργιο Σταθόπουλο, καθηγητή Φυσιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την αμέριστη στήριξή του, δίνοντάς μας τη δυνατότητα να χρησιμοποιήσουμε το εργαστήριό του στο οποίο και πραγματοποιήθηκε μέρος των πειραμάτων μας.

 Στους συνεργάτες του κ. Σταθόπουλου, που μου παρείχαν τις γνώσεις τους και τη βοήθειά τους σε όλο αυτό το χρονικό διάστημα, διασφαλίζοντας ένα άριστο κλίμα συνεργασίας.

 Στον κ. Ιωάννη Ματσούκα, καθηγητής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, για τη συμβολή του και την πίστη του στις ικανότητές μου. 

Στον κ. Γεώργιο Παναγιωτάκη, καθηγητή Ιατρικής Φυσικής του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την αμέριστη συμπαράστασή του και την παροχή των γνώσεών του. 

Στα μέλη της Τριμελούς Επιτροπής, Αναπληρωτές Καθηγητές κ.κ. Γ. Σιβολαπένκο και Γ. Πατρινό για την πολύτιμη καθοδήγησή τους.

Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή:

 Επιβλέπων: Αναπλ. Καθηγητής Κ. Πουλάς 

Αναπλ. Καθηγητής Γ. Πατρινός 

Αναπλ. Καθηγητής Γ. Σιβολαπένκο 

 Three Member Examination Committee:

 Supervisor: Αssoc. Professor Κ. Poulas 

Αssoc. Professor G. Patrinos 

Αssoc. Professor G. Sivolapenko 

 ΠΕΡΙΛΗΨΗ

 Τα οφέλη της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην ιατρική βιβλιογραφία τα τελευταία χρόνια, έχουν καταγραφεί με τα θεραπευτικά αποτελέσματα κλινικών μελετών. Το γεγονός αυτό, οδήγησε το ενδιαφέρον πολλών επιστημών, να στραφεί στην διερεύνηση των βιοχημικών μηχανισμών που επηρεάζονται και τελικά συμβάλλουν θεραπευτικά, στην εφαρμογή τεχνικών που χρησιμοποιούν την ηλεκτρομαγνητική ενέργεια. Η ασύρματη μικρο-ηλεκτροδιέγερση ή ηλεκτροδιέγερση, καθώς και η εφαρμογή παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων είναι νέες τεχνολογίες των οποίων τα αποτελέσματα εντυπωσίασαν. Τα κλινικά αποτελέσματα από την εφαρμογή της ασύρματης ηλεκτροδιέγερσης τράβηξαν το ενδιαφέρον μας, καθώς υπήρξε επιτάχυνση στην επούλωση της θεραπείας ελκών, με την δημιουργία νέων ινών κολλαγόνου και μυοϊνοβλαστών, με την μείωση της φλεγμονής καθώς και με την μείωση της κοκκιωματώδους μάζας. Σκοπός αυτής της διπλωματικής εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση που μπορεί να έχει η χορήγηση παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων σε κυτταρικές σειρές PC3 (καρκινικά κύτταρα προστάτη) και LLC (Lewis Lung carcinoma), εφόσον διαπιστώσαμε τα κλινικά αποτελέσματα της εφαρμογής της ασύρματης μικρο-ηλεκτροδιέγερσης σε ασθενείς. Θελήσαμε να εξετάσουμε πώς και εάν επηρεάζεται η μορφολογία των κυττάρων αυτών από την συγκεκριμένη τεχνική, καθώς επίσης διερευνήσαμε την πορεία της εξέλιξης του πολλαπλασιασμού των παραπάνω κυττάρων και πώς η εφαρμογή των παλμικών ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων μπορεί ή όχι να επιδράσει στην πορεία αυτή. Χορηγήσαμε σε διαφορετικούς χρόνους, με τις ίδιες συνθήκες κάθε φορά (ένταση και ενέργεια της συσκευής), παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία (PEMF) και μελετήσαμε την επίδραση της τεχνικής στην μιττωτική εξέλιξη και στον πολλαπλασιασμό των παραπάνω κυτταρικών σειρών, καθώς επίσης ελέγξαμε κατά πόσο επηρεάζεται η μορφολογία των συγκεκριμένων κυττάρων σε επίπεδο κυτταροκαλλιεργειών. Τα αποτελέσματα αυτής της διπλωματικής εργασίας αναλύονται στο δεύτερο μέρος δίνοντας τις προοπτικές εξέλιξης αυτών των πειραμάτων και σε άλλα πρωτόκολλα. Συγκεκριμένα, με την ολοκλήρωση της εργασίας διαπιστώσαμε πως η εφάπαξ χορήγηση των παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων με την συσκευή του δακτυλίου PEMF από μόνη της, δεν είναι εφικτό να προκαλέσει αλλαγή στην μορφολογία των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διπλωματική, καθώς επίσης δεν παρατηρήθηκε κάποια αλλαγή στον πολλαπλασιασμό των παραπάνω κυτταρικών σειρών.

   Λέξεις Κλειδιά: κυτταροκαλλιέργειες, κυτταρικοί πληθυσμοί, διαφοροποίηση, μικρορεύματα, ηλεκτρομαγνητικό πεδίο, ασύρματη, ηλεκτροδιέγερση.

 

ABSTRACT 

The benefits of electromagnetic radiation in the medical literature in recent years, recorded with the therapeutic effects of clinical studies. This led the interest of many sciences to focus on investigating the biochemical mechanisms that affect and ultimately contribute therapeutic, and finally to apply techniques using electromagnetic energy. Wireless micro-electrostimulation or electrostimulation, and the apply of pulsed electromagnetic fields are new technologies whose effects impressed. The clinical results from the apply of wireless electrostimulation attracted our interest, as there was accelerated healing on ulcers treatment, by the generetion of new collagen fibers and myofibroblasts, by decreasing inflammation and by reducing the granulation mass. The aim of this thesis was to study the impact that may have the administration of pulsed electromagnetic fields on cell lines PC3 (prostate cancer cells) and LLC (Lewis Lung carcinoma), as we assessed the clinical results of the implementation of wireless micro-electro on patients . We wanted to see how and if the morphology of these cells is affected by this technique, and also investigated the course of evolution of the proliferation of these cells and how the apply of pulsed electromagnetic waves may or may not affect this course. We administered at different times, with the same conditions each time (intensity and energy of the device), pulsed electromagnetic fields (PEMF) and studied the effect of this technique to mitosis and proliferation of these cell lines, and we also tested whether the morphology of these particular cells is influenced, in cell culture level. The results of this thesis are discussed in the second part giving the potentials of these experiments in other protocols as well. Specifically, with the completion of this work we found that a single dose of pulsed electromagnetic fields using the device PEMF ring by itself, is impossible to cause a change in the morphology of the cells used in this thesis, and no change in proliferation of the aforementioned cell lines was observed as well. 

    Keywords: cell culture, cell populations, differentiation, microcurrent, electromagentic field, wireless, stimulation. 

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 

ΠΡΟΛΟΓΟΣ.............................................................................................................4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.............................................................................................................8 ABSTRACT...............................................................................................................10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ......................................................................................................12 

Α Ενότητα: Η Φυσική της Ηλεκτρομαγνητικής Ακτινοβολία.................................14 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ........................................................................................15 

Ηλεκτρομαγνητική Ακτινοβολία..............................................................................15 

Ορισμός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου ......................................................................15 

Ηλεκτρομαγνητικά κύματα .....................................................................................16

 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα ......................................................................................18 

Πεδία εξαιρετικά χαμηλής συχνότητας ..................................................................20

 

Ερευνητικές Μελέτες ...............................................................................................21 

Ένταση ηλεκτρομαγνητικού πεδίου .......................................................................22 

Ακτινοβιολογία ........................................................................................................26

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΤΕΧΝΙΚΕΣ.......................................................................................29 

Α. Τεχνική της Ασύρματης Ηλεκτροδιέγερσης (ΑΗ)...............................................29 

Β. Τεχνική των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Πεδίων.........................................30 

Προηγούμενες In Vitro Έρευνες..............................................................................31

 Κυτταροκαλλιέργειες................................................................................................33 

 Β Ενότητα: Πειραματικό Μέρος .............................................................................38

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ...................................................................39

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ .....................................................................43 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: In vitro ΜΕΛΕΤΗ .............................................................................50 

Σκοπός........................................................................................................................50 

Υλικά...........................................................................................................................50 

Χαρακτηριστικά της συσκευής Wetling-200 DENMARK .......................................50 

Κυτταρικές Σειρές και Χαρακτηριστικά τους............................................................51

PC-3 (ATCC® CRL-1435™).......................................................................................51

 LL/2 (LLC1) (ATCC® CRL-1642™) (Lewis lung carcinoma)...................................53 

Μεθοδολογία Πειράματος ..........................................................................................55

 Αποτελέσματα και Συζήτηση ......................................................................................68

 Βιβλιογραφία: .............................................................................................................69 

 Α Ενότητα: 

Η Φυσική της Ηλεκτρομαγνητικής Ακτινοβολία 

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ 

Ηλεκτρομαγνητική  Ακτινοβολία 

   Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία ήταν αντικείμενο μελέτης από τα πρώτα κιόλας χρόνια της ιατρικής όταν πρώτος ο Ιπποκράτης ο οποίος υποστήριξε πως η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία προέρχεται από τον ήλιο και ανήκει στην οπτική περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος, χρησιμοποίησε την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία με σκοπό να θεραπεύσει ασθενείς με όγκο στο στήθος. Έβαλε λοιπόν τους ασθενείς να κάνουν ηλιοθεραπεία, καθώς πίστευε στις βιολογικές επιδράσεις της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στον άνθρωπο. 

   Οι προσπάθειες αντιμετώπισης και θεραπείας όγκων, αιμορραγιών καθώς και άλλων παθολογιών συνεχίστηκαν τον 18ο αιώνα χορηγώντας ηλεκτρικό ρεύμα στους ιστούς που είχαν υποστεί βλάβη. 

   Η πρώτη επιδημιολογική μελέτη πραγματοποιήθηκε από την Αμερικανίδα γιατρό Nansy Verthimer το 1974 όπου μελέτησε τις βιολογικές επιδράσεις της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην παιδική λευχαιμία. Μέρος στην συγκεκριμένη έρευνα έλαβε και ο φυσικός Ed Leeper. 

   Εκτός όμως από τις θετικές ιδιότητες της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, πολλές ήταν οι ανησυχίες για τις αρνητικές επιπτώσεις στον άνθρωπο, ώστε εκατοντάδες διεθνείς έρευνες με αντιφατικά συμπεράσματα και αποτελέσματα, από πολλά και ανεξάρτητα πανεπιστήμια και δημόσιους φορείς να έχουν πραγματοποιηθεί. 

Ορισμός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου 

   Ηλεκτρικό πεδίο ονομάζεται ο χώρος που περιβάλλει ένα ηλεκτρικό φορτίο και μέσα σε αυτόν ασκούνται δυνάμεις σε άλλα ηλεκτρικά φορτισμένα αντικείμενα. Όσο μεγαλώνει η τάση τόσο ισχυρότερο είναι το πεδίο που δημιουργείται καθώς τα ηλεκτρικά πεδία δημιουργούνται από διαφορά της τάσης. 

   Μαγνητικό πεδίο ονομάζεται ο χώρος μέσα στον οποίο ασκούνται δυνάμεις σε ηλεκτρικά ρεύματα. Όσο μεγαλύτερη είναι η ροή του ρεύματος, τόσο υψηλότερη  είναι και η ένταση του μαγνητικού πεδίου, καθώς δημιουργούνται μαγνητικά πεδία, όταν υπάρχει ροή ηλεκτρικού ρεύματος. 

    Η Ένταση του ηλεκτρικού πεδίου είναι το μέγεθος το οποίο μας δείχνει πόσο ισχυρό είναι το ηλεκτρικό πεδίο σε ένα σημείο και συμβολίζεται με Ε. Για το μαγνητικό πεδίο που περιγράφεται από την έντασή του, χρησιμοποιούμε τον συμβολισμό Η και η μαγνητική επαγωγή συμβολίζεται με Β. Όταν το πεδίο αλλάζει μέτρο και φορά τότε το ονομάζουμε μεταβαλλόμενο ή εναλλασσόμενο, εάν όμως η ένταση του πεδίου παραμένει σταθερή στον χρόνο, το πεδίο ονομάζεται στατικό. [1], [2] 

Ηλεκτρομαγνητικά κύματα

    Τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα παράγονται όταν τα ηλεκτρικά φορτία ταλαντώνονται. Τα μαγνητικά πεδία ταλαντώνονται σε κάθετα επίπεδα μεταξύ τους και κάθετα προς την διεύθυνση διάδοσης, καθώς επίσης τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα είναι συγχρονισμένα ταλαντευόμενα ηλεκτρικά. Τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα διαδίδονται στο κενό με την ταχύτητα του φωτός (c), ενώ μέσα στην ύλη διαδίδονται με ταχύτητα λίγο μικρότερη από αυτή του φωτός. Το μέγεθος των πεδίων αυτών εξαρτάται από το πόσο μεγάλη είναι η τάση ή η ένταση του ηλεκτρικού ρεύματος, και όταν αυξάνεται η απόσταση από την πηγή που τα δημιουργεί, τότε η τάση ή η ένταση μειώνεται με πολύ γρήγορο ρυθμό. Τα πεδία αυτά δεν είναι ορατά και συνήθως ούτε αισθητά. [3] 

   Μέρος των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων, όταν συναντήσουν ένα εμπόδιο, μπορεί να διαθλαστεί, να ανακλαστεί ή και να διαδοθεί μέσω του αντικειμένου ή ακόμα μπορεί να απορροφηθεί από το ίδιο το αντικείμενο. Τι όμως και σε τι ποσοστό πραγματικά θα συμβεί εξαρτάται από την γωνία πρόπτωσης, την συχνότητα του ηλεκτρομαγνητικού κύματος, από το πόσο καλός αγωγός του ηλεκτρισμού είναι το εμπόδιο καθώς και τα χαρακτηριστικά του εμποδίου. Σε ότι αφορά τον άνθρωπο, του οποίου η αγωγιμότητα δεν είναι ούτε μεγάλη, ούτε μικρή, μπορεί να συμβούν όλα τα παραπάνω. 

   Στην μέτρηση των πεδίων πολύ σημαντικό ρόλο παίζει η συχνότητα, η οποία εκφράζεται σε μονάδες Hertz. Ένα Hz ισούται με ένα κύμα ανά δευτερόλεπτο. 

   Όταν οι συχνότητες είναι μικρότερες από 10MHZ η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου καθώς και η ένταση του μαγνητικού πεδίου, είναι ασύνδετα και επομένως θα πρέπει να τα μετράμε ξεχωριστά. Αυτό δεν συμβαίνει όταν οι συχνότητες είναι μεγαλύτερες από 10 ΜΗz, καθώς σε αυτή την περίπτωση η ένταση του ηλεκτρικού και η ένταση του μαγνητικού πεδίου συνδέονται με απλές σχέσεις μεταξύ τους, όπως συνδέονται και με την πυκνότητα ισχύος P, επομένως για τον υπολογισμό τους αρκεί να μετρήσουμε το ένα μέγεθος. 

 Σχήμα 1: Ηλεκτρομαγνητικό κύμα 

    Τα βασικά χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων κυμάτων είναι: 

   - Η απόσταση η οποία καλύπτεται από ένα κύκλο κύματος και η οποία ονομάζεται μήκος κύματος, λ 

   - Ο αριθμός των κυμάτων που διέρχονται από ένα συγκεκριμένο σημείο ανά δευτερόλεπτο, που ονομάζεται η συχνότητα του κύματος, f 

   Η ταχύτητα του φωτός για οποιοδήποτε ηλεκτρομαγνητικό κύμα, ισούται με το γινόμενο του μήκους κύματος και της συχνότητας : c= λ*f ( c = 300.000 Km/s).

    Όπως έχουμε είδη αναφέρει τα ηλεκτρομαγνητικά πεδία δημιουργούνται όταν έχουμε ροή ηλεκτρικού ρεύματος μέσα σε έναν ηλεκτρικό αγωγό όπως για παράδειγμα οι ηλεκτρικές συσκευές. 

   Τα ηλεκτρομαγνητικά πεδία μπορούν να δημιουργηθούν από το φυσικό μαγνητισμό της Γης καθώς και από άλλα φυσικά φαινόμενα και άρα υπάρχουν παντού. Τα ηλεκτρομαγνητικά πεδία διακρίνονται σε φυσικά και τεχνητά ανάλογα με την πηγή της ηλεκτρομαγνητικής ενέργειας. Φυσικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία ονομάζονται εκείνα που προέρχονται από την φύση και είναι αδύνατον να αποφευχθούν. Το μαγνητικό πεδίο της γης είναι ένα παράδειγμα, όπως επίσης οι κεραυνοί μπορούν να δημιουργήσουν ηλεκτρομαγνητικά πεδία. Το ανθρώπινο σώμα  σε συγκεκριμένη θερμοκρασία εκπέμπει ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία καθώς έχει τα δικά του ηλεκτρομαγνητικά πεδία τα οποία στέλνουν σήματα στο νευρικό σύστημα. Η γη εκτός από τα στατικά πεδία, δέχεται την επίδραση ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων από τον ήλιο, ο οποίος εκπέμπει φάσμα κατά την διάρκεια των εκλάμψεων και αυτό το φάσμα περιλαμβάνει το ορατό φως, τα ραδιοκύματα, το υπεριώδες και φτάνει έως την περιοχή των ακτίνων Roentgen. Ιδιαίτερη ευαισθησία έχει το ανθρώπινο σώμα στα φαινόμενα αυτά, έτσι για παράδειγμα ο ανθρώπινος εγκέφαλος εκπέμπει στην ίδια περιοχή συχνοτήτων. Αυτό δικαιολογεί το ιδιαίτερο ενδιαφέρον προς τα φυσικά ηλεκτρομαγνητικά φαινόμενα καθώς η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που δέχεται ο άνθρωπος τα τελευταία χρόνια συνεχώς αυξάνεται. Η ένταση της ακτινοβολίας των τεχνιτών πηγών μπορεί να είναι αρκετά μεγάλη και ποικίλει ανάλογα την πηγή. [2] 

Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα 

   Ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία ονομάζεται η εκπομπή στο χώρο ηλεκτρομαγνητικής ενέργειας υπό την μορφή ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων. Ηλεκτρομαγνητικά πεδίο ονομάζεται η περιοχή στην οποία αναπτύσσονται τα κύματα. Η φύση, η πηγή, η ένταση, η συχνότητα, το μήκος κύματος και η ενέργεια που μεταφέρει η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία είναι τα βασικά χαρακτηριστικά της. 

   Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα καλύπτει το εύρος των συχνοτήτων που μπορεί να έχουν τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα, επομένως η ταξινόμηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας γίνεται με βάση την συχνότητά της, το μήκος κύματος και την ενέργεια ώστε να φαίνεται στο ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Ανάλογα με την συχνότητα τους, στο ηλεκτρομαγνητικό φάσμα μπορούμε να διακρίνουμε τα διάφορα είδη της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας πχ ραδιοκύματα, υπέρυθρη, ορατή, υπεριώδης, μικροκύματα, ακτίνες Χ, γ, καθώς επίσης και τις πηγές από τις οποίες μπορεί να προέρχονται. 

   Η ακτινοβολία διακρίνεται ανάλογα με την ενέργεια που μεταφέρει σε δύο επιμέρους περιοχές. Την ιονίζουσα και την μη ιονίζουσα. Ως ιονίζουσα ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία ορίζεται εκείνη η οποία έχει τόσο υψηλή ενέργεια που είναι ικανή να προκαλέσει ιονισμό. Η ιονίζουσα ακτινοβολία είναι μικρότερου μήκους κύματος και έχει συχνότητα υψηλότερη από το ορατό φως. Στην ιονίζουσα ακτινοβολία ανήκουν οι υπεριώδεις ηλιακές ακτίνες, η κοσμική ακτινοβολία καθώς επίσης και οι ακτίνες Χ και γάμμα (γ). Ο Ιονισμός μπορεί να προκαλέσει διάσπαση των  δεσμών του DNA των κυττάρων και αυτό είναι η αιτία πρόκλησης πολλών βλαβών για την ανθρώπινη διάσταση. 

   Όταν αναφερόμαστε στην μη-ιονίζουσα ουσιαστικά μιλάμε για την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία η οποία μεταφέρει σχετικά μικρή ενέργεια και επομένως δεν προκαλεί άμεσα ιονισμό. Μπορεί όμως να προκαλέσει θερμικές χημικές ή ηλεκτρικές επιδράσεις στα κύτταρα του ανθρώπινου και όχι μόνο οργανισμού και αυτό να έχει άλλοτε θετικές και άλλοτε αρνητικές συνέπειες. Η συχνότητα της μη-ιονίζουσας είναι μικρότερη ή ίση με αυτή του ορατού φωτός καθώς επίσης έχει μεγάλο μήκος κύματος. Σε χαμηλές ποσότητες ισχύος δεν συνδέεται άμεσα με την πρόκληση βλάβης στον άνθρωπο. Παραδείγματα αυτής της κατηγορίας ακτινοβολίας είναι η ακτινοβολία που εκπέμπεται από τις ηλεκτρικές και ηλεκτρονικές συσκευές. [4], [5], [6] 

   Οι πηγές τις μη-ιονίζουσας ακτινοβολίας αναφέρονται συνοπτικά παρακάτω: 

  -  Ορατό φως. Πρόκειται για την ακτινοβολία που μπορεί να εντοπιστεί με το ανθρώπινο μάτι (από 400 εώς 700 νανόμετρα). Το ορατό φως είναι ένα πάρα πολύ μικρό μέρος του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος 

  -  Υπέρυθρη ακτινοβολία. Τα όρια της ξεκινούν εκεί που σταματά η ορατή ακτινοβολία (700 νανόμετρα εως περίπου το 1 χιλιοστό). Η υπέρυθρη ακτινοβολία ουσιαστικά αφορά την θερμική ακτινοβολία που εκπέμπεται απο τα σώματα που βρίσκονται κοντά σε θερμοκρασία δωματίου. Η υπέρυθρη ακτινοβολία βρίσκει εφαρμογή σε αεροπλάνα, ανιχνευτές σε δορυφόρους καθώς και την αστρονομία. 

  -  Ραδιοκύματα. Το μήκος κύματος στο οποίο εκτείνονται είναι αρκετά μεγάλο (από ένα χιλιοστό εως δεκάδες και εκατοντάδες μέτρα). Μέρος των ραδιοκυμάτων αποτελούν τα μικροκύματα και το πεδίο χαμηλών συχνοτήτων).

                                                        Σχήμα 2: Εικόνες για το Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα 

Πεδία εξαιρετικά χαμηλής συχνότητας 

Τα μεταβαλλόμενα ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία που δημιουργούνται από τις διατάξεις ηλεκτρικής ενέργειες ονομάζονται και πεδία εξαιρετικά χαμηλής συχνότητας ή πεδία ELF ( extremely low frequency). Τα πεδία ΕLF είναι διαφορετικά από τα ραδιοκύματα. Τα πεδία ELF και τα ραδιοκύματα μαζί με την υπέρυθρη, την ορατή και την υπεριώδη ακτινοβολία, συνθέτουν τα φάσμα των μη- ιοντιζουσών. Οι μη ιοντίζουσες ακτινοβολίες, δεν μπορούν να διασπάσουν χημικούς δεσμούς, να αποσπάσουν ηλεκτρόνια από άτομα ή μόρια ή να προκαλέσουν δηλ. Ιοντισμό της ύλης. Οι γνωστές επιδράσεις των ηλεκτρικών και μαγνητικών πεδίων στον άνθρωπο, οφείλονται στα υπαγόμενα πεδία και ρεύματα στο εσωτερικό του κύματος, κατά την έκθεσή του στα πεδία (άμεσες επιδράσεις ). 

   Εκτός όμως από τις άμεσες υπάρχουν και οι έμμεσες, π.χ, ενοχλητικοί σπινθηρισμοί που μπορούν να δημιουργηθούν κατά την επαφή με αντικείμενα παρουσία ισχυρών πεδίων. 

Ένταση πυκνότητας ρεύματος	Επίδραση στον άνθρωπο
1000 mA/m2	Κοιλιακός Ινιδισμός
100 mA/m2	Διέγερση μυών και νεύρων (αίσθηση λάμψης στο οπτικό νεύρο).
10 mA/m2	Καμία επίδραση (όριο για τους επαγγελματικά εκτειθέμενους).
2 mA/m2	Καμία επίδραση (όριο για το κοινό).

 

   Κάθε εναλλασσόμενο μαγνητικό πεδίο που εφαρμόζεται σε ένα αγώγιμο μέσο, επάγει ηλεκτρικά πεδία που με την σειρά τους παράγουν ηλεκτρικά ρεύματα, εντός του μέσου. Από ηλεκτρικής πλευράς, το εσωτερικό του σώματος του ανθρώπου, είναι αρκετά αγώγιμο. Επιτρέπει, την ροή του ηλεκτρικού ρεύματος στο εσωτερικό του ανθρώπου, επάγοντας ηλεκτρικά πεδία και δημιουργώντας ηλεκτρικά ρεύματα. Λόγω της αγωγιμότητας του ανθρώπινου σώματος, όταν ένας άνθρωπος βρίσκεται εντός ενός ηλεκτρικού πεδίου Ε, τα διαταράσσει, ώστε η επιφάνειά του, να είναι μία ισοδυναμική επιφάνεια. Αυτό γίνεται με την παρουσία επιφανειακών ηλεκτρικών φορτίων που αντισταθμίζουν το ηλεκτρικό πεδίο. [8], [9], [10] 

   Αν λοιπόν τα ρεύματα που επάγονται στο εσωτερικό του σώματος από τα πεδία είναι πολύ ισχυρά, τότε μπορούν να επιφέρουν στον άνθρωπο τα ίδια αποτελέσματα με αυτά που δημιουργούνται, όταν τα ρεύματα εισέρχονται στο σώμα από την επαφή αγωγών υπό τάση (ηλεκτροπληξία). Αυτές οι επιδράσεις εξαρτώνται αποκλειστικά από το μέγεθος του επαγόμενου ρεύματος στο εσωτερικό του σώματος. 

Ερευνητικές Μελέτες

    Για την διερεύνηση των επιδράσεων των ηλεκτρικών και μαγνητικών πεδίων στον άνθρωπο, διεξάγονται πολλών ειδών έρευνες. ( επιδημιολογικές, εργαστηριακές, κλινικές) οι οποίες αξιολογούνται από: 

   -  Tον παγκόσμιο οργανισμό υγείας 

   -  Την διεθνή επιτροπή προστασίας από μη – Ιοντίζουσες Ακτινοβολίες (ICNIRP) 

   -  Εθνικό συμβούλιο ραδιοβιολογικής προστασίας (NRPB)                                                                       

Οι απόψεις των φορέων αυτών συγκλίνουν στα ακόλουθα συμπεράσματα. 

   -  Εργαστηριακές και κλινικές έρευνες δεν δείχνουν βλαβερή επίδραση στον άνθρωπο                   

καθώς   επίσης πειράματα σε ζώα και κύτταρα και μοριακές μελέτες δεν έχει προκύψει               

κάποιος αποδεκτός βιολογικός μηχανισμός που να ευνοεί καρκινογενετικές επιδράσεις               

των ηλεκτρικών και μαγνητικών πεδίων ELF. 

   Στις επιδημιολογικές μελέτες στο σύνολό τους, φάνηκε ότι δεν υπάρχει σύνδεση της έκθεσης σε ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία ELF με την πρόκληση μακροχρόνιων βιολογικών επιδράσεων, εκτός από την παιδική λευχαιμία για την οποία, εμφανίστηκε μία ασθενής με στατιστική συσχέτιση με το μαγνητικό πεδίο. [8], [9], [10] 

Ένταση ηλεκτρομαγνητικού πεδίου 

   Όπως αναφέραμε παραπάνω τα ραδιοκύματα αποτελούνται από ένα ηλεκτρικό και ένα μαγνητικό πεδίο. Η μονάδα μέτρησης που χρησιμοποιούμε για να μετρήσουμε την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, Ε, είναι volt ανά μέτρο (V/m), ενώ την ένταση του μαγνητικού πεδίου, Η, την μετράμε με Amber ανά μέτρο (Α/m). Ικανό να προκαλέσει προβλήματα στην ανθρώπινη υγεία είναι μόνο το μαγνητικό πεδίο και αυτός είναι και ο λόγος που επικεντρωνόμαστε στην μέτρηση της έντασης του μαγνητικού πεδίου. Ωστόσο αρκετές φορές όταν θέλουμε να μετρήσουμε την ένταση ενός πεδίου RF, κάνουμε χρήση της πυκνότητας ισχύος. H πυκνότητα ισχύος έχει ως μονάδα μέτρησης την ισχύ ανά μονάδα εμβαδού. Η πυκνότητα ισχύος μπορεί να εκφραστεί σε milliWatt ανά τετραγωνικό εκατοστό (mW/cm2 ). Σε πεδίο που εκτείνεται σε απόσταση από την κεραία μεγαλύτερη από r = 2a 2 /λ και έως το άπειρο, όπου α είναι η μέγιστη διάσταση της κεραίας και λ το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας. Ο τύπος για την πυκνότητα ισχύος είναι : Pd = E 2 /377 και Ε/Η =377 ( αν η ένταση μετρηθεί σε V/m, τότε η πυκνότητα προκύπτει σε W/m2 ). 

   Η ισχύς επομένως στο μακρινό πεδίο ακολουθεί τον νόμο 1/r 2 , αυτό σημαίνει πως όσο αυξάνεται η απόσταση η ισχύς εξασθενεί εκθετικά. Στο πεδίο που εκτείνεται από την κεραία έως την απόσταση r =2a 2 /λ, δηλαδή στο κοντινό πεδίο, τα διανύσματα του ηλεκτρικού και μαγνητικού πεδίου μεταβάλλονται πάρα πολύ γρήγορα και η μεταξύ τους σχέση είναι ιδιαίτερα περίπλοκη. Όταν λοιπόν η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία προέρχεται από κοντινό πεδίο κατά την διάρκεια της έκθεσης, τότε δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί η πυκνότητα της ισχύος ως παράμετρος δοσιμετρίας. Οι σχέσεις αυτές μπορούν να μετρήσουν πόση ενέργεια υπάρχει στον χώρο. [11] 

   Ωστόσο η ενέργεια που υπάρχει στον χώρο δεν σχετίζεται με τις επιπτώσεις που θα είχε το ανθρώπινο σώμα ή ακόμα πιο σωστά κάθε ζωντανός οργανισμός από την ενέργεια εκείνη που απορροφάται από τους διάφορους ιστούς. Η μέτρηση των αλληλεπιδράσεων ακτινοβολίας και μάζας δίνεται από τον Ειδικό Ρυθμό απορρόφησης (ΕΡΑ) ή (SAR, Specific Absorption Rate). Η μονάδα μέτρησης του είναι watt ανά κιλό (W/Kg). Οι βιολογικές επιπτώσεις από τα ηλεκτρομαγνητικά πεδία εξαρτάται από τον βαθμό απορρόφησης της ενέργειας και οι μηχανισμοί με τους οποίους μεταφέρεται η ενέργεια σε έναν ζωντανό ιστό του σώματος αφορούν την εξαναγκασμένη πόλωση των ατόμων και των μορίων των ιστών από το ηλεκτρικό πεδίο του κύματος, την διέγερση των ελεύθερων ηλεκτρονίων των ατόμων, καθώς και την ευθυγράμμιση δίπολων ατόμων και μορίων που υπάρχουν με το ηλεκτρικό πεδίο του κύματος. Ως τελικό αποτέλεσμα των παραπάνω μηχανισμών έχουμε την αύξηση της θερμοκρασίας του ιστού. 

   Ο Ειδικός Ρυθμός Απορρόφησης μπορεί να μετρηθεί από την αύξηση της θερμοκρασίας του ιστού που ακτινοβολείτε και φυσικά από το ηλεκτρικό πεδίο. Είναι πολύ σημαντικό να μην έχουμε απώλειες όταν χρησιμοποιούμε την αύξηση της θερμοκρασίας κατά την διάρκεια της έκθεσης σε ραδιοκύματα. Ο Ειδικός Ρυθμός Απορρόφησης είναι μία θερμική μονάδα μέτρησης και συνήθως υπολογίζεται από τον μέσο όρο ολόκληρου του σώματος ή από τον μέσο όρο μικρότερου όγκου (1gr ή 10gr ιστού). Αντιπροσωπεύει την ποσότητα της ενέργειας που πραγματικά απορροφάται και είναι περισσότερο αξιόπιστος παράγοντας και από την ένταση των πεδίων καθώς και την ενεργειακή πυκνότητα των πεδίων στο χώρο. Χρησιμοποιείτε παγκοσμίως για τη δοσιμετρία RF. 

Ο Ειδικός Ρυθμός   Απορρόφησης υπολογίζεται με τους τύπους :

όπου: 

            J: η μέγιστη πυκνότητα ρεύματος (A/m2 ) 

            σ: η ηλεκτρική αγωγιμότητα του ιστού (S/m) 

            ρ: η φυσική πυκνότητα (Kg/m3 ) 

   Ωστόσο είναι πολύ δύσκολο να εξασφαλίσουμε ακριβείς μετρήσεις σε ζωντανό οργανισμό. Οι μετρήσεις διεξάγονται σε υπολογιστικά και ανθρώπινα μοντέλα, ενώ στην πραγματικότητα χρησιμοποιούνται οι εντάσεις των πεδίων, καθώς είναι πιο εύκολο να τις μετρήσουμε. Μπορούμε να ελέγξουμε τον Ειδικό Ρυθμό Απορρόφησης εάν ρυθμίσουμε την ένταση του πεδίου από την πηγή μετάδοσης χωρίς αυτό βέβαια να σημαίνει πως είναι απολύτως ασφαλές.    

   Πολλοί είναι οι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την απορρόφηση της ακτινοβολίας. Η πυκνότητα της ισχύος, η συχνότητα μετάδοσης, η απόσταση από την πηγή της ακτινοβολίας, το μέγεθος, το σχήμα, ο προσανατολισμός του σώματος ως προς την ακτινοβολία, η περιεκτικότητά του σε νερό και άλλα μεταλλικά στοιχεία είναι πολύ σημαντικοί παράγοντες. Επίσης είναι διαφορετική η απορρόφηση στα μικρά παιδιά και διαφορετική η απορρόφηση στους μεγάλους καθώς διαφοροποιείται η ανατομία και η σύσταση των ιστών τους. 

   Ο τρόπος με τον οποίο εναποτίθεται στο σώμα η ενέργεια, εάν δηλαδή απορροφάται από τον ιστό συνεχόμενα ή σε παλμούς μικρής διάρκειας, ο τύπος, το σχήμα, η κυματομορφή και η διάρκεια της έκθεσης καθορίζουν και τις βιολογικές επιπτώσεις που θα υπάρξουν στους ζωντανούς οργανισμούς. 

   Ο προσανατολισμός του σώματος σε σχέση με την διεύθυνση του μαγνητικού και ηλεκτρικού πεδίου του κύματος επηρεάζει όπως αναφέραμε προηγουμένως τον Ειδικό Ρυθμό Απορρόφησης της ακτινοβολίας και μπορούμε να αναφέρουμε ενδεικτικά τρία παραδείγματα. Το κύμα να πέφτει με το ηλεκτρικό πεδίο να είναι παράλληλο με τον άξονα του σώματος, αυτόν δηλαδή που συνδέει το κεφάλι με τα πόδια, τότε λέμε πως έχουμε προσανατολισμό Ε. Το κύμα να προσεγγίζει με το μαγνητικό πεδίο να είναι παράλληλο με τον άξονα του σώματος, τότε μιλάμε για προσανατολισμό Β και τέλος η διεύθυνση διάδοσης του κύματος να είναι παράλληλη με τον άξονα του σώματος που συνδέει το κεφάλι με τα πόδια. Όταν λοιπόν ο άξονας του σώματος που συνδέει το κεφάλι με τα πόδια είναι παράλληλος με το ηλεκτρικό πεδίο, τότε βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν πως ο Ειδικός Ρυθμός Απορρόφησης παίρνει την μέγιστη τιμή του. 

Σχήμα 3: Προσανατολισμός Ε του ανθρώπινου σώματος σε σχέση με τα πεδία Ε, Β και τη διεύθυνση διάδοσης του επίπεδου Η/Μ κύματος 

   Παρακάτω φαίνεται η κατανομή της απορροφούμενης κυματικής ισχύος στις διαφορετικές περιοχές του ανθρώπινου σώματος και ο μέσος ειδικός ρυθμός απορρόφησης καθώς επίσης μπορούμε να δούμε το μέγιστο όριο δυνατής απορρόφησης σαν συνάρτηση της συχνότητας για όλες τις διαφορετικές κατηγορίες ανθρώπων, με τα σχήματα που ακολουθούν. 

                                         

                                             Σχήμα 4: Κατανομή της απορροφούμενης κυματικής ισχύος   στους διάφορους ιστούς ανθρώπινου σώματος. 

   Αυτό που συμπεραίνουμε από τα παραπάνω σχήματα είναι πως ο Ειδικός Ρυθμός Απορρόφησης παίρνει την μέγιστη τιμή του στην περιοχή από 30 MHz – 300 MHz όπου και έχουμε την μέγιστη δεκτικότητα κατά συντονισμό. Επίσης καταλαβαίνουμε πως ο Ειδικός Ρυθμός Απορρόφησης παίρνει τιμές πολύ μεγαλύτερες στα σημεία του λαιμού, τα πόδια, τους αγκώνες και την κοιλιακή χώρα συγκριτικά με τον μέσο Ειδικό Ρυθμό Απορρόφησης ολόκληρου του σώματος. Επομένως δεν θα πρέπει να εκτίθενται τα σημεία αυτά στην κυματική ενέργεια. 

Ακτινοβιολογία 

   Η ακτινοβιολογία είναι η επιστήμη που μελετά όλα εκείνα τα φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα στην ανθρώπινη βιολογία, όταν η ακτινοβολία προσκρούσει και τελικά απορροφηθεί από τους ζωντανούς οργανισμούς. Στην παρούσα διπλωματική εργασία θα εξετάσουμε πως αλληλεπιδρούν τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα με τα βιολογικά υλικά. 

   Έχουμε αναφέρει πως τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα δεν έχουν αρκετή ενέργεια ώστε να μπορέσουν να προκαλέσουν ιοντισμό στα βιολογικά υλικά. Παρά το γεγονός αυτό, η RF ακτινοβολία μπορεί και αλληλεπιδρά με τους βιολογικούς ιστούς. Τα βιολογικά υλικά έχουν ηλεκτρικές ιδιότητες επομένως καταλαβαίνουμε πως πολύ σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της RF ακτινοβολίας με τον ιστό παίζει το ηλεκτρικό πεδίο. Η αλληλεπίδραση της ύλης με το μαγνητικό πεδίο γίνεται με αρκετά μεγάλη σταθερά του χρόνου και επομένως η επίδραση του μαγνητικού πεδίου της RF ακτινοβολίας μπορεί να θεωρηθεί ουσιαστικά αμελητέα. [16] 

   Ας δούμε όμως τι συμβαίνει όταν ένας βιολογικός ιστός δεχτεί RF ακτινοβολία. Ένα μέρος της ακτινοβολίας θα διαθλαστεί, μπορεί επίσης να ανακλαστεί ή να διαδοθεί μέσω του ιστού. Μπορεί όμως να απορροφηθεί από τον ιστό. Είπαμε όμως πως τα βιολογικά υλικά έχουν διηλεκτρικές ιδιότητες, οι οποίες έχουν άμεση σχέση με την συχνότητα της ακτινοβολίας. Επίσης η περιεκτικότητα του ιστού σε νερό είναι μεγάλη και τα μόρια του νερού εμφανίζονται ως ηλεκτρικά δίπολα όπου όταν υπάρχει ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο, μπορεί να προκληθεί ταλάντωση των μορίων του νερού με διέγερση των ελεύθερων ηλεκτρονίων των ατόμων και με την αύξηση της κινητικής ενέργειας τελικά να έχουμε αύξηση της θερμοκρασίας του βιολογικού ιστού. Όταν εξετάζουμε τις αλληλεπιδράσεις της ακτινοβολίας με τους βιολογικούς ιστούς χρησιμοποιούμε δύο μεγέθη. Το βάθος διείσδυσης(δ)που είναι η απόσταση που διανύει το κύμα από την είσοδό του σε ένα ιστό εωσότου η ένταση του πεδίου του να μειωθεί στο 1/e της έντασης που είχε στην είσοδο του ιστού. Το βάθος διείσδυσης αυξάνεται όσο μειώνεται η συχνότητα και εξαρτάται από την πόλωση της ακτινοβολίας όσο και την συχνότητα. Ο τύπος που χρησιμοποιούμε όταν ένα πεδίο προσπίπτει ως επίπεδο κύμα είναι :

Εκτός από το βάθος διείσδυσης υπάρχει και η σχετική διηλεκτρική επιτρεπτότητα, ε, που δίνεται από τον τύπο: 

όπου 

εο : 8,86*10-12 f/m είναι η διηλεκτρική σταθερά του κενού 

εr : η διηλεκτρική σταθερά του υλικού και η οποία αποτελεί μέτρο της ικανότητας του υλικού να αποθηκεύει ενέργεια του ηλεκτρικού πεδίου 

σ/ω : εκφράζει το ποσοστό της ενέργειας που απορροφάται από το βιολογικό ιστό ανά Hz [12], [13], [16] 

   Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αλληλεπίδραση ενός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου με ένα βιολογικό υλικό είναι αρκετοί και αφορούν καταρχήν την ίδια την ακτινοβολία. Η ένταση, η συχνότητα και η πόλωση της ακτινοβολίας επηρεάζουν ουσιαστικά την αλληλεπίδραση. Ιδιαίτερη όμως σημασία έχει και το πεδίο εάν είναι μακρινό ή κοντινό. Έτσι η επίδραση είναι ισχυρή όταν το πεδίο είναι κοντινό καθώς η απόσταση είναι συγκρίσιμη με το μήκος κύματος. Ένα ακόμα σημαντικό σημείο είναι η απόσταση της πηγής από το βιολογικό ιστό. Τέλος το μέγεθος και το σχήμα του βιολογικού υλικού καθώς και τα χαρακτηριστικά της εσωτερικής δομής του μπορούν να διαφοροποιήσουν το αποτέλεσμα από ιστό σε ιστό. 

   Η επίδραση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας έχει νόημα να εξεταστεί ένα επίπεδο παρακάτω. Αναφέραμε πως στον ίδιο τον ανθρώπινο οργανισμό δημιουργείται ηλεκτρικό πεδίο. Για να γίνει αυτό αντιληπτό είναι χρήσιμο να δούμε τι συμβαίνει σε κυτταρικό επίπεδο. Τα κύτταρα μέσω της κυτταροπλασματικής μεμβράνης επιτρέπουν την διέλευση ιόντων και μορίων που είναι απαραίτητα να διατηρήσουν αφενός την ισορροπία στην επικοινωνία των κυττάρων μεταξύ τους και αφετέρου να συμβάλλουν στις ζωτικής σημασίας διεργασίες που επιτελούνται μέσα στο κύτταρο. Τα χιλιάδες κύτταρα επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω των μεμβρανών τους με σήματα που στέλνονται με την βοήθεια χημικών ουσιών (νευροδιαβιβαστές) και ηλεκτρικών δυναμικών. Με αυτό τον τρόπο τα κύτταρα λειτουργούν συνεργατικά ώστε να επιτυγχάνεται η εύρυθμη λειτουργία των οργάνων και τελικά ολόκληρου του οργανισμού. Για παράδειγμα η λειτουργία του εγκεφάλου στηρίζεται στην δημιουργία ηλεκτρικών δυναμικών. Όταν λοιπόν ο ανθρώπινος εγκέφαλος δεχτεί ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία η οποία έχει μεγαλύτερη ένταση ή ακόμα και παραπλήσια με αυτή που έχουν ενδογενώς τα ηλεκτρικά πεδία του ανθρώπου τότε μπορεί να επηρεαστεί το ανθρώπινο κυτταρικό σύστημα. Εξαιτίας της παρουσίας του  ηλεκτρικού πεδίου, τα ηλεκτρικά δίπολα δηλαδή τα μόρια και τα ιόντα και ιδιαίτερα το μόριο του νερού όπου το 70% του ανθρώπινου οργανισμού αποτελείται από νερό, ταλαντώνονται και αυτό οδηγεί τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα να μεταφέρουν ενέργεια στους ιστούς των βιολογικών οργανισμών και αυτό έχει ως αποτέλεσμα να έχουμε αύξηση της θερμοκρασίας των ιστών. Η απορροφούμενη ισχύς ανά μονάδα μάζας του ιστού της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας από το ανθρώπινο σώμα και η διατήρηση του πεδίου για ορισμένο χρονικό διάστημα, είναι απαραίτητα για να επιτευχθεί αύξηση της θερμοκρασίας στους βιολογικούς οργανισμούς. Επίσης εξαρτάται από τον τύπο του βιολογικού υλικού. Τα πιο ευαίσθητα από άποψη θερμοκρασίας όργανα είναι οι οφθαλμοί και οι όρχεις πιθανότατα εξαιτίας της αιμάτωσής τους. [14], [15], [16] 

   Ένα βιολογικό σύστημα ανάλογα με την επίδραση που προκαλείτε λόγω της αύξησης της θερμοκρασίας, μπορεί να παρουσιάσει θερμικές και μη θερμικές επιδράσεις. Όταν στους ιστούς που δέχονται ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία παρατηρείται μετρήσιμη αύξηση της θερμοκρασίας, πάνω από 0,1 οC η οποία προκαλείται από πυκνότητες ισχύος άνω του 1 mW/cm2 ή για μέσο ρυθμό απορρόφησης σε όλο το σώμα πάνω από 5 W/kg, τότε λέμε πως οι επιδράσεις αυτές είναι θερμικές. Στις θερμικές επιδράσεις μπορούμε να πούμε πως ανήκει και οποιαδήποτε βλάβη υποστεί ο οργανισμός από την θέρμανση των ιστών εξαιτίας της έκθεσής τους σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία και οι θερμορυθμιστικοί μηχανισμοί του οργανισμού αδυνατούν να την αντιμετωπίσουν. Ο υπολογισμός της κατανομής της θερμότητας στους ιστούς και το χρονικό διάστημα που χρειάζεται για να σταθεροποιηθεί η θερμοκρασία σε μια τιμή, πραγματοποιείται με τις διαφορικές εξισώσεις των Maxwell και από την βιοθερμική εξίσωση του Pennes. 

   Στις μη-θερμικές δεν μπορούμε να μετρήσουμε την αύξηση της θερμοκρασίας των ιστών από την έκθεσή τους σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Οι μη-θερμικές μπορούν να προκληθούν από ουσιαστικά πολύ μικρές πυκνότητες ισχύος της τάξεως πολύ λίγων μW/cm2 . Επίσης η θερμοκρασία δεν αυξάνεται περισσότερο από 0.1οC. Αυτές οι επιδράσεις μπορούν να έχουν σαν αποτέλεσμα την αύξηση της διηλεκτρικής διαπερατότητας της κυτταροπλασματικής μεμβράνης από το ηλεκτρικό φορτίο, επομένως μεταβάλετε η λειτουργία ορισμένων ενζύμων και η εκροή ιόντων ασβεστίου αυξάνεται. Τέλος υπάρχει πιθανότητα να υπάρξει μεταβολή στην διαπερατότητα του αιματοεγκεγαλικού φραγμού. Οι μη θερμικές επιδράσεις αφορούν κυρίως την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που λαμβάνει χώρα στην καθημερινότητα μας. [14], [15], [16] 

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΤΕΧΝΙΚΕΣ 

Α. Τεχνική της Ασύρματης Ηλεκτροδιέγερσης (ΑΗ) 

   Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία χρησιμοποιείται στην ιατρική για τη θεραπεία σειράς παθολογιών. Αποτέλεσμα της εφαρμογής της είναι η επιτάχυνση της επούλωσης δερματικών βλαβών, κατακλίσεων, τραυμάτων και η αναλγητική της δράση. Πάραυτα μέχρι πρότινος η χρήση της ήταν περιορισμένη εξαιτίας της δυσκολίας εφαρμογής της λόγω της ενόχλησης – πόνου με τη χρήση των ηλεκτροδίων. Με την τεχνολογία της ασύρματης μικρο-ηλεκτροδιέγερσης [Wireless Microcurrent Stimulation – WMCS] τα προβλήματα αυτά ξεπεράστηκαν. 

   Η ΑΗ δημιουργεί μετρήσιμο ρεύμα έντασης περίπου 1,5 μΑ στον ιστό, χωρίς ωστόσο να έρχεται σε επαφή με αυτόν, καθώς δεν απαιτούνται ηλεκτρόδια αγωγής. Το ρεύμα δεν περιορίζεται τοπικά αλλά κυκλοφορεί και επεκτείνει τη θεραπευτική του αποτελεσματικότητα και εν τω βάθει. Η τεχνική αυτή έχει εφαρμοστεί σε διαβητικά έλκη, έλκη από κατάκλιση, εγκαύματα καθώς και έλκη μετά από ατυχήματα. Σε κάθε περίπτωση εφαρμόστηκε για 1 ή 2 ώρες ημερησίως. 

                                                                  Εικόνα 1: Εφαρμογή ΑΗ 

                       

 Β. Τεχνική των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Πεδίων 

   Η δεύτερη τεχνική αφορά τα Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Πεδία (Pulsed Electomagnetic Fields (PEMF). Πρόκειται για μια επανορθωτική τεχνική, που αρχικά έγινε γνωστή για την χρήση της στο χώρο της ορθοπεδικής, για τη θεραπεία πολλαπλών καταγμάτων, που μπορούσαν να αποκατασταθούν άμεσα, καθώς επίσης χρησιμοποιήθηκε στην συγγενή ψευδάρθρωση, καθώς και την κατάθλιψη. [17] 

   Στην περίπτωση της οστικής αποκατάστασης η PEMF τεχνική δρά μέσω των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Πεδίων κατευθείαν στον τραυματισμένο ιστό διεγείροντας την κυτταρική επιδιόρθωση. Αυτού του είδους η τεχνική παρέχει μια συμπληρωματική λύση που βοηθά στην επιτάχυνση της επούλωσης και τελικά θεραπείας ιστικών βλαβών. [18], [19] 

   Η χρήση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας ως θεραπευτικό μέσο υιοθετήθηκε ευρέως στην Δυτική Ευρώπη. Ωστόσο στην Νότιο Αμερική περιορίστηκαν στις πειραματικές δοκιμές τεχνικών PEMF σε ζώα. [20] Οι κτηνίατροι ήταν οι πρώτοι που χρησιμοποίησαν την τεχνική με σκοπό να αντιμετωπίσουν κατάγματα στα πόδια αλόγων που έπαιρναν μέρος σε αγώνες. Στη συνέχεια φυσίατροι αποφάσισαν να πειραματιστούν δοκιμάζοντας την τεχνική και ακολουθώντας το πρωτόκολλο θεραπείας που χρησιμοποίησαν οι κτηνίατροι στα άλογα, σε επαγγελματίες αθλητές, αφού πρώτα χρειάστηκε να λάβουν την νομική άδεια για την χρήση συσκευών όπως η PEMF που προορίζονται να εφαρμοστούν στον άνθρωπο. Το 1979 η FDA ενέκρινε την χρήση μη επεμβατικών τεχνικών όπως είναι τα παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία, που σκοπό τους είχαν την συμβολή τους στη θεραπεία καταγμάτων. [21] 

   Το 2004 τα Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Πεδία έγιναν αποδεκτά από την FDA ως συμπληρωματική θεραπεία σε χειρουργημένους ασθενείς που η αποκατάσταση των καταγμάτων τους παρουσίαζαν ιδιαίτερη δυσκολία. [21] Στις 13/10/2015 η FDA αναβάθμισε την PEMF τεχνική από την κατηγορία ΙΙΙ, στην κατηγορία ΙΙ. Η αλλαγή αυτή δίνει τη δυνατότητα στους κατασκευαστές να αυξήσουν την παραγωγή τους, ώστε να τα προμηθεύουν τελικά στην αγορά. Αυτή τη στιγμή οι συσκευές που χρησιμοποιούν τεχνική PEMF, ήδη διατίθενται σε επαγγελματίες και αγοραστικό κοινό. [22] 

    Από το 1974 αποδεδειγμένα τα Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Πεδία εφαρμόζονται στην περιοχή καταγμάτων και μπορούν να συμβάλλουν στην επιτάχυνση της επούλωσής τους. [23], [24] Οι μηχανισμοί της οστεογένεσης δεν είναι ακόμα γνωστοί. Παρόλα αυτά η PEMF τεχνική χρησιμοποιείται ως συμπληρωματική θεραπεία. [23], [24] 

    Εκτός όμως από τα θεαματικά κλινικά αποτελέσματα που αναφέραμε παραπάνω, από τη χρήση των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Πεδίων στις ιστικές βλάβες η PEMF τεχνική δοκιμάστηκε και σε ασθενείς που έπασχαν από κατάθλιψη και δεν ανταποκρίθηκαν στην αντικαταθλιπτική θεραπεία. Τα αποτελέσματα αυτής της χορήγησης εντυπωσίασαν, καθώς οι ασθενείς έδειξαν βελτίωση. [25], [26], [27] Στην παρακάτω εικόνα μπορούμε να δούμε την τεχνική PEMF που αφορά έναν δακτύλιο, ο οποίος τοποθετείται στο σημείο της βλάβης, ώστε να επιδράσει θεραπευτικά. 

                                                             Εικόνα 2: Εφαρμογή PEMF 

Προηγούμενες In Vitro Έρευνες 

   Στην ανάγκη να δοθούν απαντήσεις σε σχέση με την επίδραση που έχει η ακτινοβολία στην βιολογία των κυττάρων αρκετοί ερευνητές μελέτησαν σε επίπεδο κυτταροκαλλιεργειών ποιες είναι οι επιπτώσεις στην μορφολογία και στον πολλαπλασιασμό των διαφόρων κυττάρων μετά την χορήγηση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Ενδεικτικά παρακάτω θα αναφέρουμε ορισμένες ερευνητικές προσπάθειες. 

   Η ομάδα επιστημόνων του τμήματος φυσιολογίας του πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μελέτησε τις επιπτώσεις των παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων στην καλοήθης υπερπλασία του προστάτη. Για τις ανάγκες αυτής της μελέτης πήραν μέρος είκοσι ασθενής με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη ηλικίας 68-78 και τους χώρισαν σε δύο ομάδες των δέκα ατόμων. Η πρώτη ομάδα ακολούθησε φαρμακευτική αγωγή με Alfusosin 10 mg/24ωρο για τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες. Η δεύτερη ομάδα ασθενών δέχτηκε για δύο εβδομάδες θεραπεία με παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία σύντομης διάρκειας για 30 λεπτά την φορά για πέντε συνεχόμενες ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υπήρξε μια στατιστικά σημαντική μείωση πριν και μετά την θεραπεία του IPSS (P<0.02), U/S prostate volume (P<0.05) καθώς επίσης και τα επίπεδα ρυθμού ροής των ούρων ήταν (P<0.05) σε ασθενείς που άνηκαν στην ομάδα που δέχτηκε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε αντίθεση με την ομάδα που της χορηγήθηκε μόνο Alfusosin, που η βελτίωση τους ήταν μόνο στον IPSS ήταν (P<0.05). Θεαματικά ήταν και τα αποτελέσματα στην κλινική συμπτωματολογία των ασθενών που δέχτηκαν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Η για ένα χρόνο παρακολούθηση αυτών των ασθενών δείχνει πως τα αποτελέσματα από την θεραπεία με παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία παραμένουν σταθερά. Τα οφέλη επομένως από την θεραπεία αυτή είναι ξεκάθαρα για τους ασθενείς που πάσχουν από καλοήθη υπερπλασία σε βαθμό που δεν χρειάζεται να ακολουθήσουν κάποια επεμβατική μέθοδο. [28] 

   Ακόμα μία ερευνητική ομάδα από το πανεπιστήμιο της Kyoto της Ιαπωνίας (17 Σεπτεμβρίου 2014) ασχολήθηκαν με την επίδραση του μαγνητικού πεδίου ενδιάμεσης συχνότητας 23 KHz σε 2 mT στην χημειοταξία και φαγοκυττάρωση των ουδετερόφιλων σε διαφοροποιημένα ΗL-60 ανθρώπινα κύτταρα. Από την έρευνα αυτή φάνηκε ότι η έκθεση σε μαγνητικά πεδία ενδιάμεσης συχνότητας δεν επηρεάζει ούτε την χημειοταξία και έχει ελάχιστη έως καμία επίδραση στην φαγοκυτταρική δραστηριότητα των HL-60 διαφοροποιημένων ανθρώπινων κυττάρων. [29] 

   Η επόμενη μελέτη αφορά ην χορήγηση εναλλασσόμενου ρεύματος προκαλώντας ηλεκτρική διέγερση ως ενισχυμένη χημειοθεραπεία. Μια νέα στρατηγική με σκοπό την παράκαμψη της πολυφαρμακευτικής αντίστασης των κυττάρων του όγκου. Στην μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές ( C6, HT1080, H-1299, SKOV-3, PC-3). [30] 

   Αυτό λοιπόν που διαπίστωσαν ήταν πως εφαρμόζοντας χαμηλή ένταση και χαμηλή συχνότητα ηλεκτρικής διέγερσης ενισχύεται η αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών. Το αποτέλεσμα αυτό οφείλεται σε μία αλλαγή της έκφρασης των εγγενών μηχανισμών που σχετίζονται με την κυτταρική αντοχή στα φάρμακα. Η Ανοσοϊστοχημική και η ανάλυση φθορισμού αποκάλυψε πως η ηλεκτρική διέγερση από την χορήγηση εναλλασσόμενου ρεύματος, όχι μόνο μειώνει την έκφραση του MDRI, αλλά επίσης αλλάζει και την κυτταρική κατανομή του κυτταροπλάσματος στο κυτοσόλιο. 

Κυτταροκαλλιέργειες 

   Για την πραγματοποίηση πειραμάτων με κύτταρα χρησιμοποιώντας την τεχνική των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Κυμάτων PEMF ήταν απαραίτητο να καλλιεργήσουμε κυτταρικές σειρές (PC-3 & LLC1). Παρακάτω παρουσιάζουμε τη μεθοδολογία των κυτταροκαλλιεργειών, καθώς και όλα έπρεπε να λάβουμε υπόψη για την αποτελεσματική εξέλιξη της πορείας των πειραμάτων μας: 

    Μιλώντας για κυτταρικές καλλιέργειες, αναφερόμαστε στην ανάπτυξη (πολλαπλασιασμό) κυττάρων κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες, στις οποίες τα κύτταρα έχουν απομονωθεί από τον αρχικό ιστό ή από μία αρχική καλλιέργεια (ανακαλλιέργεια) ή από μία κυτταρική σειρά ή είδος (πχ. ευκαρυωτικό ή προκαρυωτικό), με ενζυμικό, μηχανικό ή χημικό διαχωρισμό. Στην συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρούνται σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διακρίνονται σε: πρωτογενείς καλλιέργειες, όπου είναι η καλλιέργεια κυττάρων που προέρχεται από ένα ιστό ή όργανο μετά την επίδραση ενζύμων, π.χ. τρυψίνης (προσκόλληση ή όχι στο υπόστρωμα) και στις δευτερογενείς καλλιέργειες, οι οποίες προέρχονται από τις πρωτογενείς και καλλιεργούνται κατ΄ επανάληψη για εβδομάδες ή μήνες, διατηρώντας τις βασικές τους ιδιότητες π.χ. ινοβλάστες, επιθηλιακά κύτταρα (επικρατεί ένας κυτταρικός τύπος). 

   Τα σωματικά κύτταρα δεν είναι δυνατόν να καλλιεργηθούν επ΄ άπειρον. Ο αριθμός των γενεών μιας κυτταροκαλλιέργειας συμπίπτει με τον ολικό αριθμό των μιτωτικών διαιρέσεων των ίδιων κυττάρων, όταν αυτά βρίσκονται στον οργανισμό. 

   Συνεχείς κυτταρικές σειρές που μπορούν να χαρακτηριστούν ως αθάνατα καρκινικά κύτταρα, που έχουν ληφθεί απ΄ ευθείας από τον πάσχοντα οργανισμό ή από καλλιεργούμενα κύτταρα, που έχουν υποστεί κάποια αλλαγή και συμπεριφέρονται ως καρκινικά (μετασχηματισμένα, transformed). HeLa (cervical cancercells, 1951 from Henrietta Lacks). Οι κατεξοχήν κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια προέρχονται από τον οργανισμό ATCC, (www.atcc.org), του οποίου της οδηγίες παραθέτουμε: 

Συνθήκες ανάπτυξης κυττάρων: 

    Η κατάλληλη θερμοκρασία για να αναπτυχθούν τα περισσότερα κύτταρα των θηλαστικών είναι οι 37oC, ενώ αυτό γίνεται σε κατάλληλους κλίβανους, που περιέχουν 5% CO2.

    Το Θρεπτικό υλικό είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων.

 • Βασικά συστατικά: αμινοξέα, βιταμίνες, ιχνοστοιχεία, υδατάνθρακες

 • Κατάλληλοι αυξητικοί παράγοντες, αντιβιοτικά

 • Σταθερό pH (7.0-7.4)

 • (O2, CO2)

 • Επίσης 5-20% ζωικός ορός (συνήθως βόειου) ο οποίος περιέχει αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες που βοηθούν την ανάπτυξη των κυττάρων. 

 Υπόστρωμα: 

Τα κύτταρα που προσκολλούνται χρειάζονται ένα κατάλληλο υπόστρωμα. Για το σκοπό, αυτό υπάρχουν κατάλληλα επιστρωμένες μικροπλάκες που επιτρέπουν την κυτταρική προσκόλληση. Επίσης, υπάρχουν παράγοντες όπως, κολλαγόνο, λαμινίνη και ζελατίνη, που ενισχύουν ακόμα περισσότερο την προσκόλληση. 

Προβλήματα κατά την κυτταροκαλλιέργεια: 

Μολύνσεις

• Χημικές μολύνσεις: προκαλούνται από παράγοντες όπως: ενδοτοξίνη, ιόντα μετάλλων (πολύ δύσκολο να ανιχνευτούν γιατί δεν είναι ορατοί). 

• Βιολογικές μολύνσεις: περιλαμβάνουν ανάπτυξη βακτηρίων, μυκήτων, ζυμών που συνήθως εντοπίζονται εύκολα. 

   Το μυκόπλασμα και οι ιοί, που δεν είναι ορατοί, απαιτούν ειδικές μεθόδους ανίχνευσης. 

   Η απόψυξη κυτταρικής καλλιέργειας αποθηκευμένη σε υγρό άζωτο γίνεται σε κυτταρικές καλλιέργειες, που έχουν αποθηκευτεί στους -270οC σε δεξαμενή υγρού αζώτου μετά το 3ο σπάσιμο της καλλιέργειας. Κατά την απόψυξη, αρχικά, τοποθετούμε το φιαλίδιο με τα κύτταρα σε νερό θερμοκρασίας 37oC. Στην συνέχεια, το περιεχόμενο του φιαλιδίου μεταφέρεται σε διάλυμα για εξουδετέρωση του DMSO. Το διάλυμα ομογενοποιείται με pipeta και διαιρείται σε 4 φιαλίδια φυγοκέντρησης. Τα φιαλίδια φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά στις 60 στροφές ανά λεπτό. Αμέσως μετά, αφαιρείτε το αιώρημα και μοιράζεται σε 4 φιαλίδια. Το διάλυμα συγκεντρώνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα με pipeta. Στη συνέχεια, το διάλυμα αυτό τοποθετείτε σε μία φλάσκα και ακολούθως σε κλίβανο για μία εβδομάδα. 

   Η καλλιέργεια των PC3 κυττάρων γίνεται σε κατάλληλες συνθήκες και σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Η διαδικασία της ανακαλλιέργειας των καρκινικών κυττάρων πραγματώνεται με τα ακόλουθα βήματα: 

   -   Όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε πλαστικό μέσο προσκολλημένα (τρυβλίο petri) τα παρατηρούμε στο μικροσκόπιο. Η εικόνα της κατάστασης στην οποία βρίσκονται είναι ενδεικτική. Έτσι, τα κύτταρα που επιπλέουν στο θρεπτικό υλικό είναι κατά πάσα πιθανότητα νεκρά, σε αντίθεση με εκείνα που βρίσκονται προσκολλημένα στον πυθμένα. Όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται γίνεται ανακαλλιέργεια. 

   -  Αμέσως μετά γίνεται η μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 

   -  Αναρροφούμε το θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας με pipeta Pastaur υπό κενό. 

   -  Τα κύτταρα πλένονται δύο φορές με PBS. Με τον τρόπο αυτό απομακρύνονται τα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. Τα κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα και ευπαθή στην επαφή τους με τον αέρα, γι’ αυτό δεν πρέπει να μένουν για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς θρεπτικό μέσο ή PBS. Ο χρόνος που τα κύτταρα παραμένουν στο PBS (το οποίο δεν περιείχε ιόντα Ca), δεν πρέπει να είναι μεγάλος, γιατί παρατηρείται απώλεια της επαφής τους με το υπόστρωμα.

   -  Προσθέτουμε την κατάλληλη ποσότητα τρυψίνης.

   -  Παρατηρούμε στο μικροσκόπιο την αποκόλληση των κυττάρων. Ο κατάλληλος χρόνος παραμονής των κυττάρων στην τρυψίνη είναι 7 λεπτά και μπορεί να παραταθεί έως και τα 15 λεπτά.

   -  Γίνεται αναστολή της τρυψίνης με προσθήκη διπλάσιας ποσότητας πλήρους θρεπτικού μέσου (10% ορό) συγκριτικά με την ποσότητα της τρυψίνης που έχουμε προσθέσει.

   -  Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 λεπτών.

    -  Φυγοκέντρηση 4 λεπτά, 1.600 rpm, θερμοκρασία δωματίου 25 οC 

   -   Αφαιρούμε το υπερκείμενο με pipeta pasteur.

   -  Όταν απομακρύνουμε το υπερκείμενο και αφού γίνει καλή επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων, προσθέτουμε θρεπτικό υλικό έως ότου να μην υπάρχουν συσσωματώματα. 

   -  Η ποσότητα του θρεπτικού μέσου εξαρτάται από το μέγεθος του ιζήματος των κυττάρων.       -  Προσθέτουμε 10 ml από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική του υπατοκυτταρόμετρου. 

   -  Γίνεται ο υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 

   -  Σε κάθε ανακαλλιέργεια θα χρησιμοποιηθούν περίπου 80.000-100.000 κύτταρα ανά ml θρεπτικού μέσου. 

   -  Οι κυτταρικές καλλιέργειες θα πρέπει να διατηρηθούν σε επωαστή με συνθήκες απόλυτης υγρασίας στους 37οC και σε ατμόσφαιρα με 5% CO2. 

     

Αναλυτικότερα τα βήματα που ακολουθούμε για το ξεπάγωμα των κυττάρων είναι τα ακόλουθα: 

   -  Παίρνουμε από τους -80οC το φιαλίδιο με τα κύτταρα που μας ενδιαφέρουν. 

   -  Παίρνουμε ένα 50ml falcon και τοποθετούμε τα κύτταρα από το φιαλίδιο αφού πρώτα τα κάνουμε πολλές αναδεύσεις με full medium (με περίπου 4-5 ml full medium) ώστε να γίνει η επαναδιαλυτοποίηση των παγωμένων κυττάρων.

   -  Στη συνέχεια τα φυγοκεντρούμε στα 400G για 5 sec. Αναρροφούμε το υπερκείμενο και στην παλέτα (ίζημα) που έχει μείνει, προσθέτουμε 1ml full medium και τα επαναδιαλύουμε ώστε να διαλυθεί η παλέτα και να σπάσουν τα συσσωματώματα. 

   -   Τέλος προσθέτω το 1ml full medium σε ένα 60αρι πιατάκι το οποίο περιέχει 4 ml full medium. 

Splite κυττάρων 

   -  Αναρροφούμε το θρεπτικό υλικό και ξεπλένουμε 1-2 φορές με PBS (διάλυμα άλατος που έχει σαν βάση του το νερό και έχει προστεθεί μέσα φωσφορικό νάτριο ή κάλιο). 

   -  Αναρροφούμε και προσθέτουμε 1ml Τρυψίνη, για να ξεκολλήσουν τα κύτταρα. Τα χτυπάμε ελαφρά εξωτερικά από το τρυβλίο και τα αφήνουμε για λίγο. 

   -  Στη συνέχεια προσθέτουμε 4ml medium και το δουλεύουμε με την pipeta κυκλικά ώστε να ξεκολλήσουν τα κύτταρα και να σπάσουν τα συσσωματώματα.

   -  Γράφουμε σε δύο νέα πιατάκια τα στοιχεία των κυττάρων και ημερομηνία. Αμέσως μετά προσθέτουμε στο κάθε ένα 8 ml full medium και στην συνέχεια προσθέτουμε ένα ένα εναλλάξ τα 4ml από το αρχικό μας πιατάκι, ώστε να έχουμε πάρει τελικά από ένα πιατάκι με 8ml full medium και 2ml από τα κύτταρα. Τέλος, βάζουμε το κατάλληλο αντιβιοτικό. 

Πάγωμα κυττάρων 

   -  Με pipeta αναρροφούμε από το πιάτο το θρεπτικό υλικό 

   -  Ξεπλένουμε 1-2 φορές με PBS και ξανα-απομακρύνουμε. 

   -  Προσθέτουμε 1ml τρυψίνη και χτυπάμε ελαφρώς στο πλάι ώστε να βοηθήσουμε τα κύτταρα να ξεκολλήσουν. 

   -  Προσθέτουμε 3ml full medium και με την pipeta συλλέγουμε τα κύτταρα αφού πρώτα τα ξεκολλήσουμε με έντονη ανάδευση. 

   -   Συλλέγουμε το υλικό και το βάζουμε σε ένα 50αρι ή 15άρι falcon και φυγοκεντρούμε στα 400 G για 5 λεπτά.

   -   Στη συνέχεια, αναρροφούμε με pipeta το υπερκείμενο και επαναδιαλύουμε την παλέτα (ίζημα) με 2 ml freezing medium. 

   -  Αναδεύουμε συνεχώς και μοιράζουμε από 1 ml σε δύο σωληνάρια. 

   -   Μεταφέρουμε στους -80οC (1η μέρα στο φελιζόλ, επόμενη στο κουτί).

Β Ενότητα: Πειραματικό Μέρος 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 

    Η Ασύρματη Ηλεκτροδιέγερση (ΑΗ) αρχικά εφαρμόστηκε δοκιμαστικά σε ασθενείς νοσοκομείου που θέλησαν να συμμετάσχουν και οι οποίοι έπασχαν από δερματικά έλκη, κατακλίσεις, δερματικές βλάβες. Η τεχνική χορηγήθηκε σε καθημερινή βάση για περίπου μία εβδομάδα. Στην παρακάτω εικόνα Α, παρατηρούμε την βλάβη που έχει υποστεί στο άνω αριστερό άκρο μία ασθενής από έγκαυμα δευτέρου βαθμού. Στην ασθενή χορηγήθηκε ΑΗ με την τεχνική WMCS και από τη δεύτερη κιόλας ημέρα εφαρμογής της θεραπείας άρχισαν να φαίνονται τα επουλωτικά κλινικά αποτελέσματα. Έτσι λοιπόν στην εικόνα Β, που απεικονίζει την τρίτη ημέρα της εφαρμογής φαίνεται η θετική εξέλιξη της δερματικής αυτής βλάβης. Η φλεγμονή έχει αισθητά μειωθεί και η ασθενής αναφέρει ότι ο πόνος έχει ελαττωθεί. Την πέμπτη ημέρα της εφαρμογής της τεχνικής, όπως φαίνεται στην εικόνα C, η βλάβη έχει σχεδόν αποκατασταθεί και η ασθενής δεν αναφέρει πλέον πόνο. Κατά την ολοκλήρωση της θεραπείας με ασύρματη ηλεκτροδιέγερση οι δερματικές βλάβες του χεριού έχουν πλέον αποκατασταθεί και η φλεγμονή έχει υποχωρήσει οριστικά. Η εικόνα D επιβεβαιώνει κλινικά την αποτελεσματικότητα της τεχνικής της ΑΗ. 

                                                                 Εικόνα 3: Κλινικά αποτελέσματα (α) 

       Οι εικόνες που ακολουθούν Α, Β, C αφορούν την εφαρμογή της ΑΗ σε έναν ασθενή που πάσχει από διαβήτη και εξαιτίας της νόσου του το ακρωτηριασμένο του άκρο έχει υποστεί δερματικό έλκος. Στην εικόνα Α μπορούμε να δούμε την σοβαρότητα της βλάβης αυτής. Με την έναρξη της εφαρμογής της τεχνικής παρατηρούμε την άμεση επούλωση των βλαβών, την μείωση της φλεγμονής και φυσικά τη δημιουργία νέων ινών κολλαγόνου. Την τρίτη ημέρα θεραπείας ο ασθενής παρουσιάζεται με ιδιαίτερα βελτιωμένη την κλινική του εικόνα, κάτι που διαφαίνεται στην εικόνα Β. Εντυπωσιακό είναι το αποτέλεσμα προς το τέλος της θεραπείας, την έβδομη ημέρα εφαρμογής της τεχνικής. Το δερματικό έλκος έχει πλέον αποκατασταθεί και η φλεγμονή έχει πλέον υποχωρήσει. 

    Ένα ακόμα παράδειγμα από την εφαρμογή της ΑΗ, αφορά μια ηλικιωμένη ασθενής, όπου μετά από αρκετούς μήνες ακινησίας, παρουσίασε βαριά μορφή  κατάκλισης. Από την πρώτη εικόνα (δεξιότερα από τις εικόνες Α, Β, C) μπορούμε να δούμε πόσο μεγάλη είναι η έκταση της βλάβης. Η ασθενής αναφέρει πόνο και λειτουργική δυσκολία. Στην εικόνα που ακολουθεί μπορούμε να δούμε τα εντυπωσιακά αποτελέσματα προς το τέλος της θεραπείας, με την τεχνική της ΑΗ. Αναμφίβολα, εκτός από την αποκατάσταση των ιστικών βλαβών, πολύ σημαντική ήταν και η αναφορά της ασθενούς για μείωση του πόνου. 

                                                        Εικόνα 3: Κλινικά αποτελέσματα (β και γ) 

    Όπως φαίνεται και τα παραπάνω κλινικά αποτελέσματα, διαπιστώθηκε ότι με την εφαρμογή της τεχνικής ΑΗ συμβαίνει επιτάχυνση της επούλωσης των βλαβών, καθώς δημιουργούνται νέες ίνες κολλαγόνου και μυοϊνοβλαστών, μειώνεται η φλεγμονή και η κωκκιωματώδης μάζα. 

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ 

    Η Ασύρματη Ηλεκτροδιέγερση (ΑΗ) [Wireless Microcurrent Stimulation – WMCS] είναι λοιπόν μια νέα μέθοδος που εφαρμόστηκε πιλοτικά στην θεραπεία τραυμάτων, και η οποία έχει συγκριτικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις συμβατικές συσκευές ηλεκτροδιέγερσης. Παρόλο που η συμβατική ηλεκτροδιέγερση είναι ευρέως γνωστή για τα θεαματικά της αποτελέσματα όσον αφορά τη διαδικασία επούλωσης τραυμάτων σε ασθενείς με διαβήτη τύπου ΙΙ, νεότερες μελέτες αφήνουν ανοιχτά ενδεχόμενα εξίσου θεαματικών αποτελεσμάτων με εφαρμογή ασύρματης ηλεκτροδιέγερσης. Παραδείγματα τέτοιων μελετών είναι: 

   Η Ανοσοϊστοχημική μελέτη της δράσης της ασύρματης ηλεκτροδιέγερσης στη θεραπεία ελκών και τραυμάτων: 

   Η ασύρματη ηλεκτροδιέγερση (Α.Η.) χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ελκών και τραυμάτων που παρουσιάζουν δυσκολία επούλωσης. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας δυο κλινικά περιστατικά, μελετάμε το μηχανισμό δράσης της, διερευνώντας την ενεργοποίηση διαφόρων μοριακών και/ή κυτταρικών παραγόντων που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στην επούλωση των ιστών. 

   Για τη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Wetling-200, Denmark σε δύο ασθενείς: Ο πρώτος, έπασχε από νόσο Dupuytren με προσβολή της παλαμιαίας απονεύρωσης στο μέσο και παράμεσο δάκτυλο και παραμορφωτική αρθρίτιδα δείκτου και μέσου δακτύλου δεξιάς χειρός. Ο δεύτερος, υπέστη τραυματισμό (εργατικό ατύχημα) στο αριστερό χέρι με έλλειμμα δέρματος στο παράμεσο δάκτυλο. Η θεραπεία που εφαρμόστηκε ήταν ωριαίας διάρκειας καθημερινά (ένταση 1,5 μA). Πραγματοποιήθηκε ανοσοιστοχημική μελέτη σε βιοψίες των 2 ασθενών για α) δημιουργία ινών κολλαγόνου, β) παρουσία μαστοκυττάρων και γ) ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών. 

   Σαν αποτέλεσμα ο πρώτος ασθενής παρουσίασε σαφή βελτίωση, μείωση των εκκρίσεων και αποστείρωση του τραύματος από τη 4η μετεγχειρητική μέρα και πλήρη επούλωση του τραύματος σε 14 ημέρες. Ο δεύτερος παρουσίασε θεαματική επούλωση στο έλλειμμα δέρματος από τη δεύτερη θεραπεία. Σε 14 ημέρες αποκαταστάθηκαν πλήρως τα τραύματα και αφαιρέθηκαν τα ράμματα. Ανοσοϊστοχημικά παρατηρήθηκε -συναρτήσει του αριθμού των θεραπειών- αύξηση της δημιουργίας ινών κολλαγόνου, αύξηση του πολλαπλασιασμού των μυοϊνοβλαστών και μείωση της συγκέντρωσης των φλεγμονωδών κυττάρων. 

    Συμπερασματικά λοιπόν, όπως φαίνεται από την παρούσα μελέτη, η ΑΗ δρα αποτελεσματικά στη θεραπεία των ελκών, ελαττώνοντας το χρόνο επούλωσης  επάγοντας τη δημιουργία νέων ινών κολλαγόνου αλλά και μυοϊνοβλαστών, ενώ παράλληλα μειώνει τη φλεγμονή και την κοκκιωματώδη μάζα. [31] 

   Παρακάτω παρατίθονται εικόνες των ανοσοϊστολογικών αποτελεσμάτων της παραπάνω μελέτης. 

  Εικόνα 1: Η&Ε: Granulation tissue with acute                                                                                                                     neutrophilic reaction

    Στην παραπάνω εικόνα παρατηρούμε κοκκιώδη ιστό ο οποίος παρουσιάζει οξεία ουδετεροφιλική αντίδραση. Η εικόνα αυτή πάρθηκε πριν την εφαρμογή της τεχνικής μας WMCS. Μετά την εφαρμογή της τεχνικής πάρθηκαν επίσης εικόνες:

Εικόνα 2: H&E: Granulation tissue with less                                                                                                                                                          inflammation and increased fibroblastic activity 

   Στην παραπάνω εικόνα βλέπουμε ότι ο κοκκιώδης ιστός παρουσιάζει αισθητά μειωμένη φλεγμονή και υπάρχει αύξηση της δραστηριότητας των ινοβλαστών. Ακολουθεί η εικόνα, όπου προς το τέλος της εφαρμογής της τεχνικής, φαίνεται ότι ο κοκκιώδης ιστός είναι πολύ λιγότερος και έχουμε ακόμα πιο αυξημένη δραστηριότητα των ινοβλαστών. 

Εικόνα 3: H&E:Less granulation tissue and even more                                                                                                      increased fibroblastic activity 

Ακολουθούν οι εικόνες από τα CD117 καθώς και εικόνες των μαστοκυττάρων, οι οποίες ελήφθησαν σε διαφορετικές φάσεις της εξέλιξης της εφαρμογής της τεχνικής: 

Εικόνα 4: CD117: Many CD117+ mast cells 

   Όπως λοιπόν μπορούμε να δούμε στην παραπάνω εικόνα, τα μαστοκύτταρα καθώς και τα CD117 είναι ιδιαίτερα ανεπτυγμένα και ενώ έχει ξεκινήσει η εφαρμογή της τεχνικής παρατηρείται μείωση της αντίδρασης των μαστοκυττάρων, την οποία μπορούμε να δούμε στην επόμενη εικόνα: 

  Εικόνα 5: CD117: Reduced mast cell reaction

    

      Τέλος, κατά το τέλος της εφαρμογής της ΑΗ με την τεχνική της WMCS παρατηρούμε       ότι   έχουν απομείνει μόνο λίγα διάσπαρτα CD117 και μαστοκύτταρα, όπως φαίνεται   στην  επόμενη  εικόνα: 

          

Εικόνα 6: CD117: Few scattered mast cells 

Συμπερασματικά λοιπόν, η τεχνική ΑΗ επέδρασε εντυπωσιακά μειώνοντας αφενός τον κοκκιώδη ιστό στην περίπτωση των πρώτων τριών εικόνων και αφετέρου παρατηρήσαμε την μείωση της αντίδρασης των μαστοκυττάρων στην περίπτωση των τριών τελευταίων εικόνων. 

    Μια δεύτερη μελέτη είναι η επίδραση της ασύρματης ηλεκτροδιέγερσης στην ανάπτυξη βακτηρίων, με κλινικά και in vitro αποτελέσματα. Σε αυτήν μελετήθηκε η επίδρασή της στη μικροβιακή ανάπτυξη, καθώς μπορεί να ευνοεί ή να ανταγωνίζεται τη θεραπευτική/επουλωτική δράση της. Η διαπίστωση της ηλεκτροδυναμικής της στα μικρόβια θα οδηγήσει σε βελτιωμένα, μικτά σχήματα αγωγής και φροντίδας.  

   Σε αυτήν την μελέτη χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Wetling-200 σε καλλιέργειες βακτηριακού κλινικού δείγματος, μη ταυτοποιημένου και αγνώστου καθαρότητας (δις τυφλό). Τροποποιημένα τρυβλία επιστρώθηκαν με τιτλοδοτημένο βακτηριακό εναιώρημα και υποβλήθηκαν σε διαφορετικές εντάσεις (0,5 – 4 μΑ) για διαφορετικούς χρόνους (1, 10, 30, 60 min), ταυτόχρονα με πανομοιότυπα τρυβλίαμάρτυρες. Ακολουθούσε επώαση στους 37 οC, με καταμέτρηση αποικιών στις 24 και στις 48 ώρες και μέτρηση διαμέτρου χαρακτηριστικών αποικιών στις 48 ώρες. Παράλληλα, από δύο ασθενείς ελήφθη επίχρισμα από τα τραύματα προ και μετά την αγωγή ΑΗ (1,5 μΑ για 60 min / συνεδρία) που εναιωρείτο, καλλιεργείτο με επίστρωση και καταμετρούνταν αποικίες. 

    Σαν αποτέλεσμα τα επιχρίσματα των ασθενών παρουσιάσαν σαφή, σταδιακή μείωση του μικροβιακού φόρτου κατά την πρόοδο της αγωγής. Μετά από μικρό αριθμό συνεδριών τα τραύματα ήταν πρακτικά στείρα. Αντίθετα, τα τρυβλία που υποβλήθηκαν σε ΑΗ εμφάνισαν αποικίες μεγαλύτερης διαμέτρου, σε σχέση με τα αντίστοιχα τυφλά, με τη διαφορά συναρτημένη με την ένταση και το χρόνο ΑΗ. Επίσης, εμφανίστηκε αυξημένη ποικιλομορφία αποικιών, ενώ δεν παρατηρήθηκε στάθμιση στις διαφορές του αριθμού των αποικιών. 

    Αυτό που φάνηκε τελικά είναι ότι η ΑΗ μειώνει έως μηδενισμού τον ρυθμό ανάπτυξης των βακτηρίων in vivo. Αντίθετα, τον ευνοεί σε συνθήκες καλλιέργειας, και επάγει την εμφάνιση φαινοτυπικών διαφοροποιήσεων. [32] 

 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ 

Σκοπός 

Στα in vitro πειράματά μας θελήσαμε να εξετάσουμε την επίδραση της ασύρματης μικρο-ηλεκτροδιέγερσης με την τεχνολογία των παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων (Pulsed electromagnetic fields PEMF), στην μορφολογία και τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυτταρικών σειρών (PC-3, LLC). 

Υλικά 

Χαρακτηριστικά της συσκευής Wetling-200 DENMARK 

Προδιαγραφές Συσκευής:

Φέρουσα Συχνότητα:                             27.12 MHz

Ανώτατη Ισχύς:                                       72 milliWatts/cm2 Ρυθμός Παλμού: 1 KHz

Διάρκεια Παλμού:                                 100 microsecond

Πηγή Ενέργειας:                                     Μπαταρία

Μέγεθος Κεραίας:                                  12 cm ή 8 cm

Περιοχή Θεραπείας:                              100 cm2 από 70 cm2

Βάρος:                                                       8 γραμάρια

Διάρκεια Θεραπείας:                             24-ώρες την ημέρα

Διάρκεια Ζωής Μπαταρίας:                  720 ώρες on/off δυνατότητα

Κυτταρικές Σειρές και Χαρακτηριστικά τους 

PC-3 (ATCC® CRL-1435™) 

ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ:

Οργανισμός                           Homo sapiens, άνθρωπος

Ιστός                                        Προστάτης, που προέρχονται από

                                                  μεταστατικό σημείο: οστά

Μορφή Προϊόντος                Παγωμένα

Μορφολογία                           Επιθηλιακά

Ιδιότητες Δείγματος             προσκολλημένα (Τα κύτταρα σχηματίζουν

                                                   συστάδες σε μαλακό άγαρ και μπορούν να  

                                                   προσαρμοστούν ώστε να αναπτύσσονται

                                                    σε αιώρημα)

Επίπεδο Βιο-ασφάλειας         1

                                                   Η ταξινόμηση της Βιο-ασφάλειας  

                                                   στηρίζεται στις οδηγίες της Αμερικάνικης Δημόσιας Υπηρεσίας      

                                                   Υγείας και είναι στην υπευθυνότητα των πελατών να

                                                   διασφαλίσουν ότι είναι εναρμονισμένες με τους κανονισμούς

                                                    Βιο-ασφάλειας της χώρας τους.

Ασθένεια                                   βαθμού IV, αδενοκαρκίνωμα

Ηλικία                                        62 χρονών ενήλικας

Φύλο                                           Άρρεν

Εθνικότητα                               Καυκάσιος

Εφαρμογές                                Αυτή η κυτταρική σειρά είναι κατάλληλος ξενιστής επιμολύνσεων

Συνθήκες Αποθήκευσης          Φάση ατμών υγρού αζώτου 

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ:

 Καρυότυπος                        Η γραμμή είναι σχεδόν τριπλοειδή με έναν τυπικό αριθμό από 62                                                              

                                                 χρωμοσωμάτα. Υπάρχουν περίπου 20 χρωμοσώματα δείκτες που

                                                 βρίσκονται συνήθως σε κάθε κύτταρο και δεν βρέθηκαν φυσιολογικά

                                                 Ν2, Ν3, Ν4, Ν5, Ν12, Ν15. Δεν μπόρεσαν να ανιχνευτούν και

                                                 φυσιολογικά χρωμοσώματα Υ με ανάλυση Q-ζώνης.

  Εικόνες  

                                           

Παραγωγή                            Η PC-3 σειρά προέρχεται από μια μετάσταση στα οστά, βαθμού IV

                                                προστατικού αδενοκαρκινώματος, από έναν 62-χρονο αρσενικό

                                                Καυκάσιο.

Κλινικά Δεδομένα               62 χρονών ενήλικας, Καυκάσιος, Άρρεν Η PC-3 σειρά προέρχεται

                                                από μια μετάσταση στα οστά, βαθμού IV προστατικού

                                                αδενοκαρκινώματος, από έναν 62-χρονο αρσενικό Καυκάσιο.

 Έκφραση Αντιγόνου         HLA A1, A9

Γονίδιαπου εκφράζονται    HLA A1, A9

Ογκογονικά                            Ναι

Αποτελέσματα                       Ναι, σε ήμι-στερεο μέσο Ναι, όγκοι αναπτύχθηκαν εντός 21

                                                  ημερών σε 100% συχνότητα (5/5) σε γυμνούς ποντικούς που

                                                  εμβολιάστηκαν υποδορίως με 10(7) κύτταρα.

Σχόλια                                     Τα κύτταρα εμφανίζουν χαμηλό οξύ φωσφατάσης και

                                                   τεστοστερόνης-5-άλφα αναγωγάσης   . 

 

 

LL/2 (LLC1) (ATCC® CRL-1642™) (Lewis lung carcinoma)

ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ: 

Οργανισμός                                    Mus musculus, ποντίκι

Ιστός                                                Πνεύμονας

Μορφή Προϊόντος                        Παγωμένα

Μορφολογία                                  Στρογγυλεμένα - χαλαρά συνδεδεμένα ή επιπλέοντα

Ιδιότητες Δείγματος                    Μικτό, προσκολλημένα και εναιώρημα

Επίπεδο Βιο-ασφάλειας              1

                                                         Η ταξινόμηση της Βιο-ασφάλειας στηρίζεται στις οδηγίες της

                                                         Αμερικάνικης Δημόσιας Υπηρεσίας Υγείας και είναι στην

                                                         υπευθυνότητα των πελατών να διασφαλίσουν ότι είναι

                                                        εναρμονισμένες με τους κανονισμούς Βιο-ασφάλειας της χώρας

                                                        τους.

 Ασθένεια                                      Καρκίνωμα πνεύμονα Lewis

Κατάλοιπα                                    C57BL

Εφαρμογές                                   Αυτή η γραμμή χρησιμοποιείται ευρέως ως ένα μοντέλο για

                                                        μετάσταση και είναι χρήσιμο για τη μελέτη των μηχανισμών

                                                        χημειοθεραπευτικών παράγοντες καρκίνου.

Συνθήκες Αποθήκευσης           Φάση ατμών υγρού αζώτου 

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ: 

Παραγωγή                                   Το καρκινώματος πνεύμονα Lewis είναι μία κυτταρική γραμμή   

                                                       προερχόμενη από τον πνεύμονα ενός C57BL ποντικού που φέρει

                                                       όγκο που προκύπτει από την εμφύτευση πρωτογενούς

                                                       καρκινώματος πνεύμονα Lewis.

Έκφραση Αντιγόνου                 H-2b

Ογκογονικά                                 Ναι

Αποτελέσματα                            Ναι, σε C57BL ποντίκια

Σχόλια                                          Τα κύτταρα είναι ανθεκτικά σε 1,3-bis-(2-χλωροαιθυλο)-1-

                                                       νιτροζουρία, αλλά είναι ευαίσθητα στην μεθοτρεξάτη. Τα κύτταρα

                                                       αναφέρθηκαν ως άκρως ογκογονικά, αλλά ασθενώς μεταστατικά

                                                       σε ποντίκια. Τα κύτταρα σχηματίζουν πολλαπλές στρώσεις σε

                                                       φιάλες χωρίς πραγματικά να συμβάλλουν. Ελέγχθη και είναι

                                                       αρνητικά για τον ιό ectromelia (mousepox). 

ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΕΣ: 

Χρόνος διπλασιασμού του πληθυσμού           21 ώρες 

Μεθοδολογία Πειράματος

 Τα πειράματά μας όλα πραγματοποιήθηκαν με ιδιαίτερη προσοχή σε πολύ συγκεκριμένες συνθήκες. Αρχικά δουλέψαμε με τα PC-3 κύτταρα. Μελετήσαμε στο μικροσκόπιο την μορφολογία των κυττάρων, την μιτωτική τους πορεία και εξασφαλίσαμε τις κατάλληλες για τα κύτταρα συνθήκες. Τα κύτταρα σε όλα τα πειράματα βρίσκονται στην τρίτη ημέρα μετά τo splite, όπου τα κύτταρα έχουν καλύψει περίπου το 60% του τρυβλίου και βρίσκονται σε μιτωτική διαδικασία. H συσκευή Anti-Patch έχει 8 ημέρες ζωής και απαραίτητη προυπόθεση ώστε να μπορέσει να δράσει είναι να βρίσκεται 3,5 εκατοστά από την επιφάνεια. 

    Στο πρώτο πείραμα χρησιμοποιήσαμε τα PC-3 κύτταρα, την τρίτη ημέρα μετά το splite. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν ώστε να έχουμε εικόνα των κυττάρων πριν από το πείραμα. Για τις ανάγκες της διπλωματικής εργασίας χρησιμοποιήθηκε το μικροσκόπιο φθορισμού Olympus BX50 με φωτισμό πρόσπτωσης (epifluorescent microscope). Η συλλογή των εικόνων έγινε από μια έγχρωμη CCD κάμερα (XC30, Olympus) που είχε κατάλληλα προσαρμοστεί στο μικροσκόπιο. Η συλλογή των εικόνων φθορισμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντικειμενικού 20xUPlan, με αριθμητικό άνοιγμα ΝΑ = 0,50.  

   Τοποτετήσαμε το τρυβλίο στα 3,5 εκατοστά και αφαιρέσαμε το καπάκι του τρυβλίου.

    Στεραιώσαμε τον δακτύλιο στο τρυβλίο, έχοντας πρώτα ενεργοποιήσει την συσκεύη. Η τεχνική εφαρμόστηκε στα κύτταρα για 10 λεπτά. Εκτός από το τρυβλίο στο οποίο εφαρμόσαμε την τεχνική, είχαμε και ένα τρυβλίο με κύτταρα τα οποία χρησιμοποιήσαμε ως μάρτυρα. Όταν πέρασαν τα 10 λεπτά αφαιρέσαμε τον δακτύλιο, τοποθετήσαμε το καπάκι στο τρυβλίο και τοποθετήσαμε το τρυβλίο στον κλίβανο. Το πρώτο πείραμα ολοκληρώθηκε 24ωρες μετά όπου παρατηρήσαμε τα κύτταρα στο μικρόσκόπιο, ώστε να ελέγξουμε την μορφολογία των κυττάρων μετά το πείραμα, καθώς επίσης να παρατηρήσουμε την εξέλιξη της μιτώτικής διαδικασίας. Το τρυβλίο μάρτυρας 24ώρες μετά το πείραμα είχε καλύψει με κύτταρα περίπου το 85% του τρυβλίου καθώς επίσης και το τρυβλίο στο οποίο εφαρμόστηκε η τεχνική δεν φάνηκε να επηρεάζεται απο τα παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία.

                                                       Εικόνα 7: PC-3 κύτταρα: Τρυβλίο Control ΠΡΙΝ το πείραμα. 

    Στην εικόνα αυτή παρατηρούνται τα κύτταρα που βρίσκονται στην τρίτη ημέρα μετά το split, να είναι σε μιτωτική διαδικασία. Καμία μορφολογική επιπλοκή δεν υπάρχει σε αυτήν την εικόνα. 

                                               Εικόνα 8: PC-3 κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ τα πειράματα. 

   Στην εικόνα αυτή βλέπουμε πως 24 ώρες μετά το πείραμα τα κύτταρα δεν έχουν επηρεαστεί ούτε στη μορφολογία τους ούτε στην μιττωτική τους διαδικασία. 

    Στο δεύτερο πείραμα χρησιμοποιήσαμε τα ίδια κύτταρα (PC-3), στις ίδιες συνθήκες ( την τρίτη ημέρα μετά το splite, με το τρυβλίο να έχει καλύψει το 60% με κύτταρα και την συσκεύη του δακτυλίου τοποθετημένη μαζί με το τρυβλίο στα 3,5 εκατοστα). Αυτή την φορά εφαρμόσαμε παλμικά ηλεκτρομαγνητικά κύματα για 30 λεπτά. Παρατηρήσαμε τα κύτταρα πριν απο το πείραμα και χρησιμοποιήσαμε ένα τρυβλίο για μάρτυρα. Και αυτό το πείραμα ολοκληρώθηκε 24ώρες μετά. Όπου είδαμε πως ούτε ο μάρτυρας αλλά ούτε το τρυβλίο στο οποίο εφαρμόσαμε την τεχνική είχε κάποια μη αναμενόμενη μεταβολή.

                                             Εικόνα 9: PC-3 κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα εφαρμογής 30'.

     Ακολούθησε το τρίτο πείραμα στο οποίο δουλέψαμε με τα ίδια κύτταρα εφαρμόζοντας το πρωτόκολλο με την ίδια ακρίβεια. Αυτό που διαφοροποιήθηκε σε αυτό το πείραμα ήταν ο χρόνος που χορηγήσαμε την τεχνική. Αυτή την φορά, τα παλμικά ηλεκτρομαγνητικά κύματα εφαρμόστηκαν για 1 ώρα και 30 λεπτά. Όταν ολοκληρώθηκε και αυτό το πείραμα διαπιστώσαμε πως τα κύτταρα έμεινα ανεπηρέαστα.

                                        Εικόνα 10: PC-3 κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα εφαρμογής 1h και 30'. 

    Επαναλάβαμε το πείραμα, με τα ίδια κύτταρα και τις ίδιες συνθήκες, χορηγώντας αυτή την φορά τα παλμικά ηλεκτρομαγνητικά πεδία για 3 ώρες. Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος παρατηρήσαμε πως τα κύτταρα δεν εμφάνισαν κάποια αλλαγή ούτε στην μορφολογία τους αλλά ούτε και στον πολλαπλασιασμό τους. Αυτό το βλέπουμε στην εικόνα που ακολουθεί:

                                         Εικόνα 11: PC-3 κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα εφαρμογής 3h. 

     Τέλος στα ίδια κύτταρα με το ίδιο πρωτόκολλο, εφαρμόσαμε την τεχνική over night. Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος 24 ώρες μετά και πάλι τα κύτταρα δεν εμφάνισαν κάποια μεταβολή, όπως φαίνεται στην αμέσως επόμενη εικόνα:

     

                                                   Εικόνα 12: PC-3 κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα εφαρμογής 24h. 

       Το πρωτόκολλο αυτών των πειραμάτων το εφαρμόσαμε στην συνέχεια και με τα LLC κύτταρα. Έτσι λοιπόν, στο πρώτο από αυτά τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν τη δεύτερη ημέρα μετά το split η τεχνική εφαρμόστηκε αρχικά για 10΄. Παρακάτω παρατηρούμε την εικόνα των κυττάρων πριν εφαρμόσουμε το πείραμα:

  

                                                   Εικόνα 13: LLC κύτταρα: Τρυβλίο Control ΠΡΙΝ το πείραμα. 

       Εικοσιτέσσερις ώρες μετά το πρώτο πείραμα με τα κύτταρα LLC1 λάβαμε χαρακτηριστική εικόνα, η οποία φαίνεται παρακάτω: 

Εικόνα 14: LLC κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα χορήγησης για 10'

     Όπως φαίνεται από το πρώτο πείραμα δεν παρατηρήθηκε ιδιαίτερη μεταβολή ούτε στην μορφολογία ούτε στην ανάπτυξη των κυττάρων. 

     Ακολούθησε το δεύτερο πείραμα με τα LLC1 κύτταρα, στις ίδιες συνθήκες, εφαρμόζοντας αυτή τη φορά Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Κύτταρα για 30'. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά το πείραμα λάβαμε την παρακάτω εικόνα: 

                                    Εικόνα 15: LLC κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα χορήγησης για 30'.

       Ούτε εδώ υπήρξε κάποια αλλαγή στην εικόνα των κυττάρων. 

     Αμέσως μετά, ακολούθησε το τρίτο πείραμα στο οποίο χρησιμοποιήσαμε τα ίδια κύτταρα, εφαρμόζοντας με την ίδια ακρίβεια το πρωτόκολλο. Αυτό που διαφοροποιήθηκε ήταν ο χρόνος που χορηγήσαμε την τεχνική, καθώς αυτή τη φορά τα Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Κύματα εφαρμόστηκαν για 1 h και 30'. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα έμειναν ανεπηρέαστα. Παρακάτω ακολουθεί η εικόνα που λάβαμε μετά από αυτό το πείραμα:

                            Εικόνα 16: LLC κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα χορήγησης για 1h και 30'.  

       Ακολούθησε το επόμενο πείραμα, όπου με τα ίδια κύτταρα χορηγήσαμε την τεχνική για 3 ώρες. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή ούτε στη μορφολογία τους αλλά ούτε στον πολλαπλασιασμό τους, κάτι που φαίνεται στην εικόνα που ακολουθεί:

                                                Εικόνα 17: LLC κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα ΜΕΤΑ το πείραμα χορήγησης για 3h. 

      Τέλος, στα ίδια κύτταρα, με το ίδιο πρωτόκολλο εφαρμόσαμε την τεχνική over night. Σε αυτό το πείραμα θα μπορούσαμε με επιφύλαξη να αναφέρουμε πως 24 ώρες μετά τα κύτταρα δεν είχαν καλύψει το τρυβλίο σε όλη την επιφάνεια με κύτταρα όπως στα προηγούμενα πειράματα. Ωστόσο η μορφολογία των κυττάρων δεν είχαν υποστεί κάποια αλλαγή. Αυτά φαίνονται στην επόμενη εικόνα:

                          Εικόνα 18: LLC κύτταρα: Χαρακτηριστική εικόνα των μορφολογικών αλλοιώσεων των κυττάρων                                                                μετά  από overnight χορήγηση της τεχνικής σε συγκεκριμένα σημεία του  τρυβλίου. 

Αποτελέσματα και Συζήτηση 

      Από την εφαρμογή της τεχνικής των παλμικών ηλεκτρομαγνητικών πεδίων στις κυτταρικές σειρές PC3 και LLC σε διαφορετικούς χρόνους κάθε φορά, διαπιστώσαμε πως η εφάπαξ δόση της συγκεκριμένης τεχνικής ακόμα και αν αλλάζαμε το χρονικό διάστημα της χορήγησης δεν προκάλεσε κάποια αλλαγή στην μορφολογία των παραπάνω κυτταρικών σειρών, καθώς επίσης δεν φάνηκε να επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός των παραπάνω κυττάρων από την τεχνική. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων αυτών χρειάστηκε να επαναλάβουμε τα πειράματά μας, ώστε να είμαστε σίγουροι ότι τα αποτελέσματα που λάβαμε αρχικά δεν είχαν επηρεαστεί από κάποιον εξωγενή παράγοντα. Στην επανάληψη λοιπόν των πειραμάτων και πάλι δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή. 

      Αρχικά επιλέξαμε να δουλέψουμε με την κυτταρική σειρά PC-3 καθώς από τη βιβλιογραφική μελέτη που έγινε η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά είχε ανταποκριθεί στη χορήγηση χαμηλής έντασης και συχνότητας ηλεκτρικής διέγερσης. [30] Βέβαια, στη συγκεκριμένη μελέτη εφαρμόστηκε ΑΗ σε καθημερινή βάση, ενώ στη δική μας περίπτωση χορηγήσαμε Παλμικά Ηλεκτρομαγνητικά Πεδία εφάπαξ κάθε φορά. Εφόσον λοιπόν διαπιστώσαμε πως η τεχνική PEMF δεν είχε κάποιο αποτέλεσμα στα PC-3 κύτταρα αποφασίσαμε να επαναλάβουμε τη δοκιμή και σε μια άλλη κυτταρική σειρά, ώστε αφενός να ελέγξουμε τα αποτελέσματά μας κι αφετέρου να συγκρίνουμε τις πιθανές αλλαγές. Παρά το γεγονός ότι τα LLC1 κύτταρα είναι διαφορετικής μορφολογίας και παρουσιάζουν διαφορετικούς ρυθμούς ανάπτυξης, ούτε και αυτά φάνηκαν να επηρεάζονται από την τεχνική των Παλμικών Ηλεκτρομαγνητικών Πεδίων στις εφάπαξ δόσεις. 

        Με επιφύλαξη όμως, μπορούμε να αναφέρουμε πως στο πείραμα με την εφαρμογή της τεχνικής over night διακρίναμε μια μικρή καθυστέρηση στην εξέλιξη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία μορφολογική μεταβολή. Ωστόσο αυτό είναι ένα αποτέλεσα που σίγουρα χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Καθώς τα κύτταρα μετά το πέρας του 24ώρου, δεν τα χρησιμοποιούσαμε ξανά, επομένως και δεν γνωρίζουμε πώς θα εξελίσσονταν μετά από αυτό το χρονικό διάστημα, δεν μπορούμε να είμαστε σίγουροι για πιθανή διαφορετική εξέλιξη. Όπως ανέφερα παραπάνω, από προηγούμενες μελέτες συμπεραίνουμε πως η χορήγηση πολύ χαμηλών συχνοτήτων ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας έχουν με επιφύλαξη επίδραση σε κυτταρικές σειρές και εφόσον έχουν χορηγηθεί καθημερινά σε συγκεκριμένες δόσεις και συνεργατικά με άλλες στρατηγικές θεραπείας. Σε συνέχεια της μελέτης μας θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε την τεχνική μας στις κυτταρικές σειρές μας, σε καθημερινή βάση, ώστε να διαπιστώσουμε αν σε αυτήν την περίπτωση υπήρχαν κλινικά αποτελέσματα που να δείχνουν αισθητές μεταβολές. 

Βιβλιογραφία:

 1. Griffiths, D. J. “Introduction to Electrodynamics”. Prentice Hall. p. 58, 1999. 

2. Τσιμούκης, Θ. “ Ηλεκτρομαγνητικό πεδίο. Βασική Θεωρία και εφαρμογές”. Πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης, Τόμος 1, σελ. 463 – 487, Μάρτιος 2011. 

3. “Physics. Classical Waves / 03 – Maxwell Equations”. Κεφ. 31. 

4. Demarest K.R. “Engineering Electromagnetics”. Prentice Hall International 1998. 

5. Kraus/Fleisch. “Electromagentics with Applications”. McGraw-Hill International Editions 1999. 

6. Μαργαρίτης Λ. Χ. “Ηλεκτρομαγνητισμός”. Πανεπιστήμιο Αθηνών. 2015.

 7. “Χαμηλόσυχνα ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία”. ΕΕΑΕ (Ελληνική Επιτροπή Ατομικής Ενέργειας). Αθήνα, 2005. 

8. Κλούρος Ν., Περλεπές Σπ. “Εισαγωγή στην Κβατική Θεωρία, Ατομική Δομή”. Τόμος Α. 

9. “Σημειώσεις Εργαστηρίου Βιοφυσικής Ακτινιοβολιών” του τμήματος Βιολογίας, τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, του Πανεπιστημίου Αθηνών. 2015. 

10. Λουίζη Α. “Μη Ιονίζουσα Ηλεκτρομαγνητική Ακτινοβολία(ΗΜΓ). Φυσικές Αρχές – Βιολογικές Επιδράσεις – Κανονισμοί και Όρια Προστασίας”. 

11. Tccc.iesl.forth.gr/education/local physics I/magnetism-1 Κεφάλαιο 27 Pearson Education. 2009. 

12. “Non-Ionizing Electromagnetic Radiation in the Radiofrequency Spectrum and its Effects on Human Health” Latin American Experts Committee on High Frequency Electromagnetic Fields and Human Health June 2010. 

13. Ιακωβάκης Δημήτριος Β. “Μη ιονίζουσα ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία και η βιολογικές της επιδράσεις”. Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Τομέας Συστημάτων Μετάδοσης Πληροφορίας και Τεχνολογίας Υλικών, Διπλωματική Εργασία, Αθήνα 2008. 

14. Κουλουλίας Ε. Βασίλειος. "Εισαγωγή στην Ραδιοβιολογία". ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, Β΄ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΚΤΙΝΟΛΟΓΙΑΣ, ΑΤΤΙΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ, 2013. 

15. Πλατανιώτης ΓΑ. “Κλινική Ραδιοβιολογία”. Εκδόσεις University Studio Press, Επιστημονικών Βιβλίων και Περιοδικών, 2000. 

16. Τσούγκος Ιωάννης. “Ακτινοβιολογία”. ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ, ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ, 2008. 

17. Bassett CA, Schink-Ascani M, Lewis SM. "Effects of Pulsed Electromagnetic Fields on Steinberg Ratings of Femoral Head Osteonecrosis". Columbia Presbyterian Medical Center. September 1989 

18. Markov, Marko S. "Expanding Use of Pulsed Electromagnetic Field Therapies". Electromagnetic Biology & Medicine 26 (3): 257–274. 2007. 

19. Mooney, V. "A randomized double-blind prospective study of the efficacy of pulsed electromagnetic fields for interbody lumbar fusions". Spine 15 (7): 708– 712. 1990. 

20. Roeser R, Valente M. AUDIOLOGY, 3-Volume Set: Diagnosis, Treatment and Practice Management. 342: Thieme. p. 2000. 2007. ISBN 1604066970. 

21. "Electrical stimulation of the spine as an adjunct to spinal fusion procedures". Blue Cross & Blue Shield of Mississippi. Pulsed electromagnetic field systems with FDA PMA include the EBI Bone Healing System from Electrobiology, Inc., which was first approved in 1979 and indicated for nonunions, failed fusions, and congenital pseudarthroses; and the Cervical-Stim from Orthofix, which was approved in 2004 as an adjunct to cervical fusion surgery in patients at high risk for non-fusion.” 

22. "FDA Executive Summary - Orthopaedic and Rehabilitation Devices Panel". Fda.gov. 2014. 

23. Boopalan, PRJVC; et al. "Pulsed electromagnetic field (PEMF) treatment for fracture healing". Current Orthopaedic Practice 20 (4): 423–428. August 2009. 

24. REC Rose, BA Bryan-Frankson. "Is there still a role for pulsed electromagnetic field in the treatment of delayed unions and nonunions". The Internet Journal of Orthopedic Surgery 10 (1). 2008. 

25. Martiny K, Lunde M, Bech P.; Lunde; Bech. "Transcranial low voltage pulsed electromagnetic fields in patients with treatment-resistant depression". Society of Biological Psychiatry 68 (2): 163–9. 2010.

26. Rohan M, Parow A, Stoll AL, Demopulos C, Friedman S, Dager S, Hennen J, Cohen BM, Renshaw PF. "Low-field magnetic stimulation in bipolar depression using an MRI-based stimulator". Am J Psychiatry 161 (1): 93–8. 2004. 

27. Aksoz E, Aksoz T, Bilge SS, Ilkaya F, Celik S, Diren HB. "Antidepressant-like effects of echo-planar magnetic resonance imaging in mice determined using the forced swimming test". Brain Res. 1236: 194–9. 2008. 

28. Γιαννακόπουλος Κ. Ξ., Γιώτης Χ. “Effects of Pulsed Electromagnetic Fields on benigh prostate hyperplasia”. Τμήμα Φυσιολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. 2011. 

29. Koyama Shin, Narita Eijiro, Shinohara Naoki, Miyakoshi Juinji. “Effect of intermediate frequency magnetic field of 23 Khz at 2 mT chemotaxis and phatocytosis in neutrophil like differenciated human HL-60 cells”. Kyoto University of Japan. 2014. 

30. Damin Janigro, Catalin Perju, Vincent Fazio, Kerrin Hallene, Gabriel Dini, Mukesh K. Agarwal and Luca Cuculo. “Alternating current electrical stimulation enhanced chemotherapy: a novel strategy to bypass multidrag resistance in tumor cells”. Published online. 2006. 

31. Λαγουμιντζής Γ, Καμπούρης ΜΕ, Αργυράκος Θ, Καραγκούνης Γ, Βουτσινάς Αλ, Βουτσινάς Αγ, Πουλάς Κ. “Ανοσοϊστοχημική μελέτη της δράσης της ασύρματης ηλεκτροδιέγερσης στη θεραπεία ελκών και τραυμάτων”. Τμήμα Φαρμακευτικης, Πανεπιστήμιο Πατρών. 

32. Πουλάς Κ, Καμπούρης ΜΕ, Κούγια Ε, Λαγουμιντζής Γ, Βανταράκης Α. “Επίδραση της Ασύρματης Ηλεκτροδιέγερσης στην ανάπτυξη βακτηρίων: Κλινικά και in vivo αποτελέσματα”. Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, 2009.